|
1. Методы исследования противовирусных препаратов в культуре клеток
Первичный отбор препаратов следует начинать с исследований отобранных веществ синтетического или природного происхождения в культуре клеток.
Оценка антивирусной активности препаратов сводится к контролю репродукции вируса. Ниже кратко описаны основные методы, применяемые для определения ингибиции инфекционной активности вирусов:
1)микрометод;
2) определение цитопатогенного действия (ЦПД);
3) метод флуоресцирующих антител (МФА);
4) метод ингибиции бляшкообразования;
5) реакция гемагглютинации;
6) реакция гемадсорбции;
7) радиоизотопный метод;
8) радиоиммунный анализ (РИА);
9) реакция иммунофлюоресценции (РИФ);
10) метод иммуноферментного анализа (ИФА);
11) молекулярные методы (молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в реальном времени);
12) методы электронной микроскопии;
13) оценка противовирусного действия препаратов in vitro.
1.1. Микрометод
Оптимизация методов первичного отбора противовирусных препаратов в культуре клеток развивалась по линии создания систем, позволяющих одновременно оценивать большое количество соединений. Прогрессивным методом этого плана исследований следует считать микрометод, являющийся экономичным и довольно простым [3, 27]. По этому методу культуру клеток выращивают в пластиковых панелях с 96 лунками, в каждую из которых вносят по 0,1 мл вируссодержащей суспензии и затем — по 0,1 мл поддерживающей среды, содержащей исследуемые вещества с кратностью разведения 1:2, начиная с концентрации 1000 мкг/мл. Через 48—72 ч (сроки максимального накопления вируса) культуру клеток микроскопируют для определения титра по ЦПД и вычисления индекса селективности препаратов.
В качестве второго критерия оценки можно использовать вычисление титра в над- осадочной жидкости. Представленный метод является чувствительным и позволяет проводить одновременное исследование большого количества соединений (4 препарата на панель) при минимальном расходе питательных сред и изучаемых веществ.
С помощью микрометода можно оценить одновременно цитотоксические и противовирусные свойства вещества, во-первых, по степени ингибиции вирусспецифического ЦПД, во-вторых, по снижению 50% ингибирующей дозы и, в-третьих, по степени ингибиции микробляшкообразования [34].
1.2. Определение цитопатогенного действия
Большинство вирусов (покс-, герпес-, миксо-, парамиксо-, тогавирусы и др.) вызывают четко выраженный цитопатогенный эффект в перевиваемых и первично-трипсинизированных клетках человеческого и животного происхождения. Описано множество методик оценки вирусингибирующего действия химиопрепаратов с использованием этого теста при выращивании клеток в пробирках, на матрасах и пластиковых панелях. Последние получили наиболее широкое распространение, так как позволяют использовать культуру клеток в микрообъемах и оценивать одновременно большое количество соединений при минимальном расходе питательных сред и изучаемых веществ. Микрометоды оценки противовирусных препаратов на основе ЦПД используют для исследования вирусов полио-, адено-, герпеса, везикулярного стоматита и др.
Суть этих методов заключается в предварительной обработке 24-часовой культуры клеток, выращенных в 96-луночных пластиковых панелях, разными концентрациями исследуемого препарата за 24 ч до заражения различными дозами соответствующего вируса. Учет результатов производят при полном развитии ЦПД (деструкции клеток) в контроле. Положительным считают результат, при котором отмечается 50% подавление размножения вируса по сравнению с контролем.
1.3. Метод флуоресцирующих антител
Метод флуоресцирующих антител (МФА) используют в лабораторной практике по отбору вирусных ингибиторов в культуре клеток значительно реже, чем метод на основе ЦПД вирусов. Следует отметить, что этот метод имеет несколько вариантов, применяют как прямой, так и непрямой МФА. Эффективность препарата может быть оценена по сравнительной интенсивности свечения в клетках экспериментальной и контрольной групп в течение одного цикла репродукции вируса, по подсчету количества светящихся или инфицированных клеток (%) в присутствии препарата и без него [36], по определению титра вируса.
МФА для первичного исследования противовирусных средств в культуре клеток, в основе которой лежит определение титра вируса, включает 2 этапа:
1-й этап (МФА-1) — предварительное определение подавляющего эффекта с одновременной оценкой токсичности соединений для культур клеток,
2-й этап (МФА-2) — определение действия активных соединений на накопление вируса в культуре клеток (26).
1-й этап. Оценка токсичности и предварительное изучение вирусингибирующего действия соединений проводятся одновременно, что позволяет экономить время, материалы и получать результаты уже после первого исследования. Для проведения такого исследования берут не менее трех концентраций препарата с 10-кратными разведениями и на каждую дозу — три конечных разведения вируса (с учетом его титра). Обычно используют перевиваемые линии клеток (СПЭВ, ВНК-21 и др.), которые выращивают на покровных стеклах в пробирках или в микропланшетах. Исследуемый вирус вносят в культуру клеток и помещают на 50-60 мин в термостат при 37 °С. Затем инокулят удаляют, клетки трижды отмывают от неадсорбированного вируса и в пробирки заливают поддерживающую среду, содержащую препараты в различных концентрациях. Так, если исследуемый химиопрепарат в концентрации 1000 мкг/мл оказывает цитотоксическое действие (ЦТД) на клетки, по данным прижизненного морфологического исследования, то снижение его дозы в 10 раз может не только не оказать на клетки токсического действия, но и привести к снижению титра вируса на 1,0 lg.
Достоинством данного метода является одновременная оценка токсичности и предварительное изучение вирусингибирующего действия соединений. Причем следует подчеркнуть, что токсическое влияние препарата изучается на инфицированной культуре клеток. Инфекционный титр вируса определяют через 48 ч после заражения клеток вирусом и выражают в ТЦД50/мл. Репродукцию вируса учитывают с помощью прямого МФА с контрастированием фона. Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии проводят по общепринятой методике [30]. Концентрации препарата, оказывающие повреждающее действие на клетки, по данным прижизненного морфологического исследования (ЦТД), оценивают как токсические. Максимально переносимой концентрацией препарата (МПК), нетоксичной для клеток, обычно считают 1/2 от концентрации, не оказывающей ЦТД. Минимально эффективная вирусингибирующая концентрация (МЭК) — это концентрация препарата, снижающая титр вируса не менее чем на 1,5 lg (26). Инфекционный титр вируса определяют с помощью МФА по 4-крестовой системе и выражают в ТЦД50/мл [36]. Вирусингибирующий эффект оценивают по снижению титра вируса препаратами и степени (%) подавления.
Препараты, проявляющие вирусингибирующее действие (не менее 95%), подлежат дальнейшему изучению в культуре клеток для определения их влияния на накопление вируса.
2-й этап. Используют «пристеночную» культуру клеток, выращенную в пробирках. Методика инфицирования клеток и введения препаратов не отличается от описанной выше. Концентрации препаратов колеблются от МПК и ниже с двукратным шагом. Для каждой инфицирующей дозы вируса используют не менее 4 пробирок. Через 48 ч инкубации клетки разрушают трехкратным замораживанием и оттаиванием, содержимое пробирок объединяют по группам и титруют по МФА для определения концентрации репродуцированного возбудителя. Вирусингибирующий эффект оценивают по кратно¬сти снижения титра вируса в экспериментальной группе по сравнению с контрольной. Одновременно определяют ХТИ препарата.
Описанная методика оценки вирусингибирующего действия химиопрепаратов с использованием МФА является весьма чувствительным тестом при первичном отборе и исследовании противовирусных средств. Этот метод позволяет проводить количественную оценку противовирусной активности соединений с получением достоверных результатов.
1.4. Метод ингибиции бляшкообразования
Наибольшее распространение при оценке противовирусного действия химиопрепаратов в культуре клеток получил метод подавления бляшкообразования. Основным методом для первичного исследования антивирусных свойств химиопрепаратов в культуре клеток является скрининг-тест. Этот метод обеспечивает большую пропускную способность. В основе метода лежит одна из наиболее точных и признанных методик количественного определения вирусов — методика подавления бляшкообразования. Использование этого метода получило особенно широкое распространение в последние годы, когда были разработаны условия для получения бляшек большинства вирусов. Существуют различные модификации этого метода.
В настоящее время получение высокоочищенных ингредиентов, входящих в состав питательного покрытия, а также новых культур клеток позволяет проводить культивирование практически всех известных вирусов. Агар-диффузионный скрининг-тест предполагает изучение соединений в широком диапазоне концентраций.
После формирования клеточного монослоя во флаконах или в чашках Петри ростовую среду удаляют, клетки промывают и инфицируют в течение часа в термостате, после чего инфицирующий инокулят удаляют и монослой заливают средой (содержащей испытуемый препарат или не содержащей), соединенной с агаром. После застывания агара флаконы переворачивают так, чтобы слой агара находился вверху, и помещают в термостат при 36 °С. На 3 день инкубации во флаконы добавляют второе агаровое покрытие, содержащее нейтральный красный в разведении 1:1000. Флаконы с застывшим вторым слоем агара снова помещают в термостат. Через 3-20 ч (в зависимости от скорости репликации вируса в клетках) проводят учет количества бляшек в опытных и контрольных флаконах.
Оценка результатов исследования может быть проведена путем сравнения подсчитанного количества бляшек в опытных и контрольных чашках (флаконах).
1.5. Реакция гемагглютинации
Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способности некоторых вирусов (орто- миксо-, парамиксо- флави-, тогавирусы и др.) агглютинировать эритроциты ряда животных. Данную реакцию используют для оценки противовирусного действия препаратов в отношении вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью. При использовании этого теста надо иметь в виду, что не всегда торможение РГА коррелирует со способ¬ностью препарата подавлять инфекционную активность вируса.
1.6. Реакция гемадсорбции
Реакция гемадсорбции основана на способности культур клеток, зараженных вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты и является наиболее чувствительной для ортомиксо-и парамиксовирусов. Вирусингибирующий эффект препаратов оценивают по уменьшению количества гемадсорбированных клеток в экспериментальной группе по сравнению с контролем. В качестве примера можно привести использование подавления гемадсорбции вируса гриппа А для оценки эффективности амантадина, ремантадина, рибавирина и 2-дезокси-0-глюкозы. Описано использование метода гемад- сорбции для оценки других антивирусных препаратов в отношении некоторых ортомиксовирусов.
1.7. Радиоизотопный метод
Ускоренный метод оценки противовирусной активности соединений в культуре клеток, который основан на определении синтеза нуклеиновых кислот по включению меченых предшественников: 3Н-уридина (РНК) и 3Н-тимидина (ДНК), является высокопроизводительным и позволяет одновременно оценивать большое количество веществ (100 проб за 3 ч). По мнению исследователей, данный метод более чувствителен, чем скрининг-тест редукции бляшек. Вместе с тем следует подчеркнуть, что обязательным условием этого метода является использование культур клеток, свободных от микоплазм, которые разрушают аденин и уридин.
1.8. Радиоиммунный анализ (РИА)
Метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивает высокую чувствительность в определении вирусного антигена. Широкое распространение получил этот метод в 80-е годы, особенно для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. К недостаткам этого метода относится необходимость работы с радиоактивными веществами и использование дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).
1.9. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например изотиоцианатом флюоресцеина. На практике применяют 2 варианта РИФ: прямой и непрямой.
При прямом методе РИФ применяют меченые красителем антитела к вирусам, которые наносят непосредственно на инфицированные клетки (мазок). Реакция таким образом протекает одноэтапно.
При непрямом варианте РИФ на исследуемый материал наносят специфическую сыворотку, антитела которой связываются с вирусным антигеном, находящимся в исследуемом материале, а затем наслаивают антивидовую сыворотку к гамма-глобулинам животного, из которого получали специфическую иммунную антисыворотку. Преимущество непрямого метода состоит в потребности лишь одного вида меченых антител.
1.10. Метод иммуноферментного анализа (ИФА)
Принцип иммуноферментного анализа (ИФА) основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.). Для изучения активности химических соединений или противовирусных препаратов в культуре клеток используют модифицированный ИФА, который позволяет выявить уровень экспрессии вирусных антигенов (вирусных белков) на поверхности клеток в опытных и контрольных пробах. Использование метода ИФА, модифицированного для оценки противовирусной активности соединений в культуре клеток, позволяет проводить эксперименты быстро, получать количественные, объективные и хорошо воспроизводимые результаты. К неоспоримым преимуществам этого метода относится и то, что 96-луночный формат планшета позволяет исследовать большое число соединений одновременно, используя их в малом количестве. Применение ИФА позволяет уменьшить количество сред, клеток и самого тестируемого соединения примерно в 10-100 раз по сравнению с определением противовирусной активности с применением методов ингибирования БОА или ЦПД.
Клетки рассаживают в 96-луночные планшеты для культивирования клеток с плоским дном и выращивают до полного монослоя в соответствующей среде с сывороткой. Перед заражением вирусом клетки 2 раза промывают средой без сыворотки, далее исследуемые соединения добавляют к клеткам в 2-кратной концентрации. Часть лунок используют для контроля вируса и клеток. После инкубации клеток с исследуемыми препаратами в течение 2 ч при 37 °С в лунки, исключая клеточный контроль, добавляют вирус, разведенный на используемой среде, при этом множественность заражения должна составлять приблизительно от 0,1 до 10 ТЦИД50 на клетку в зависимости от условий эксперимента. Планшеты инкубируют в течение 17-24 ч в зависимости от вируса и условий эксперимента в атмосфере 5% СО2 при 37 °С. После этого клетки планшета просматривают под инвертированным микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии в них цитотоксических и цитопатических изменений. Далее среду удаляют, клетки фиксируют, хорошо высушивают и отмывают 3 раза фосфатным буфером с 0,05% Твин-20. Все дальнейшие процедуры проводят в соответствии с техникой постановки ИФА для выявления антигена, разработанного для соответствующего вируса. По окончании реакции на спектрофотометре для измерения оптического поглощения в 96-луночных планшетах проводят измерение оптической плотности (ОП) каждой лунки при длине волны 492 нм или 450 нм при использовании в качестве хромогенов ортофенилендиамина или 3-3/-5-5/-тетраметилбензидина соответственно. Значение ОП в контроле клеток не должно превышать 0,2, а значение ОП вирусного контроля должно превышать значение ОП контроля клеток не менее чем в 4-5 раз. Процент ингибирования вирусной репродукции изучаемым соединением определяют по формуле:
Для одной точки опыта используют 3 или 4 лунки планшета, из которых опреде-ляют среднее значение, при этом отклонения значения ОП каждой из точек от него не должны составлять больше 10-15%. Концентрация препарата или соединения, умень¬шающая значение величины ОП на 50%, принимается за ингибирующую концентрацию 50 (ИК50).
1.11. Молекулярные методы
Классическим методом выявления вирусного генома считался высокоспецифичный метод гибридизации НК. Однако в настоящее время все шире используется выделение геномов вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Метод основан на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК с образованием двунитиевых структур и на выявлении с их помощью изотопной метки. Для этой цели используют специальные ДНК- или РНК-зонды, меченые изотопом (32Р) или биотином, которые обнаруживают комплементарные нити ДНК или РНК.
Существуют несколько вариантов метода:
Точечная гибридизация. Выделенную и денатурированную НК наносят на фильтры и затем добавляют меченый зонд. Индикация результатов учитывается с помощью авто-радиографии при использовании 32Р или окрашиванием при авидин-биотине.
Блот-гибридизация. Выделение фрагментов НК, нарезанных рестрикционными эндонуклеазами из суммарной ДНК. Фрагменты переносят на нитроцеллюлозные фильтры и тестируют с помощью меченых зондов.
Гибридизация in situ позволяет определять НК в инфицированных клетках.
ПЦР. Идея ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК (ген можно размножить в пробирке, увеличивая количество копий в миллионы раз).
Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусспецифической последовательности ДНК. Для проведения ПЦР нужны пара специфических олигонуклеотидов (праймеров), комплементарных исследуемому фрагменту и фермент (термостабильная ДНК-полимераза). В определенных условиях праймеры способны распознавать гомологичные последовательности в денатурированной ДНК, связываться с ними и служить затравкой для ферментативного синтеза копий участка изучаемого гена.
Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом.
Первая стадия - выделение ДНК (РНК) из образца. На данной стадии, которая осуществляется при температуре 94°С, образец подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, денатурация НК (удаление белковых и полисахаридных фракций) и получение раствора НК, свободной от примеси ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации.
На второй стадии два олигонуклеотидных праймера, строго специфичных (гомологичных) к определенным участкам антипараллельных цепей исследуемой ДНК, связываются (образуют гибриды с помощью водородных связей) с этими участками ДНК (стадия отжига).
На третьей стадии, протекающей при температуре 70-72°С с участием термофильной ДНК-полимеразы и дезоксинуклеозид-5-трифосфатов, происходит синтез новых це-пей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов (праймеров) с исследуемой ДНК. Матрицей для синтеза служат исходные цепи ДНК (стадия полимеризации).
В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25-30 циклов накопить достаточное количество копий выбранного участка ДНК для ее определения. Количество исходной ДНК увеличивается в миллион и более раз.
В большинстве методик на третьем этапе производится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на второй стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. До проведения электрофоретического разделения к амплификационной смеси добавляют раствор бромистого этидия, образующий прочные соединения с двуцепочечными фрагментами ДНК. Под действием УФ-облучения эти соединения способны флюоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в геле. Специфичность полосы подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и положительному ДНК-контролю. Дополнительные доказательства специфичности ампликона получают методами рестрикционного анализа, гибридизации и прямого секвенирования.
Метод высокоточен и очень чувствителен. Он позволяет обнаружить несколько копий вирусной ДНК (РНК) в исследуемом материале.
Для повышения специфичности и чувствительности анализа в некоторых методиках используют метод «гнездной» (nested) ПЦР, в котором используют 2 пары праймеров («внешние» — для 1 стадии и «внутренние» — для второй стадии).
ПЦР -анализ РНК-содержащего инфекционного материала. Для ПЦР-анализа РНК-содержащего материала (например ВГС, ВКЭ) предварительно проводят стадию обратной транскрипции — получение ДНК, комплементарной РНК-матрице, для чего используют специфические праймеры к РНК и фермент — РНК-зависимую ДНК полимеразу (обратную транскриптазу, ревертазу). Далее ПЦР-анализ проводят по схеме, описанной выше.
В настоящее время в практическое здравоохранение внедряется новая технология ПЦР - ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Принципиальной особенностью данного метода является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов ПЦР и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот ме¬тод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР-лаборатории.
1.12. Метод электронной микроскопии
Электронную микроскопию (ЭМ) используют для изучения механизма противовирусного действия соединений. С помощью этого метода можно обнаружить собственно вирус. Для успешного определения концентрация возбудителя в пробе должна быть примерно 1х10*6 частиц в 1 мл. Поскольку, как правило, концентрация вируса в исследуемом материале значительно ниже, идентификация возбудителя требует предварительного его осаждения при помощи высокоскоростного центрифугирования с последующим негативным контрастированием.
Метод ЭМ дает неполное представление о цикле репродукции вирусов, особенно ранних этапов (эклипс-фаза, синтез ранних вирусспецифических ферментов и др.), которые протекают без существенного изменения ультраструктуры инфицированных клеток.
Кроме того, данный метод не позволяет типировать вирусы ввиду отсутствия морфологических различий у многих представителей внутри семейства.
Более перспективным представляется использование иммунной ЭМ, которая позволяет обнаруживать появление ранних антигенов, а также антигены на клеточной поверхности и вирусспецифические рецепторные структуры. При этом методе применяются специфические антитела к вирусам, в результате чего образуются комплексы, которые после легче обнаруживаются после негативного контрастирования.
Недостатком методов ЭМ является то, что они требуют сложного технического оснащения и их использование при проведении первичного отбора проблематично.
| 
