ФИКСАЦИЯ В ГИСТОХИМИИ

Целью фиксации биологического материала для гистохимического анализа является перевод живого вещества из лабильного состояния в стабильное, т.е. прекращение процессов аутолиза и стабилизация веществ и структур клетки в такой мере, при которой их локализация, целостность и взаимное расположение практически не изменяются при последующем обезвоживании, заливке в парафин или в смолу, приготовлении срезов, а также под воздействием пучка электронов, если проводится ультрацитохимический анализ. Для достижения этой цели возможны три подхода: высушивание, замораживание и химическая фиксация.

Наиболее часто как в гистологической, так и гистохимической практике используют метод химической фиксации. На его результаты влияют время, прошедшее после взятия материала, продолжительность фиксации, рН и изотоничность фиксирующей среды, температура и химические свойства выбранного фиксирующего реагента. Очень важное значение имеет время, прошедшее от прижизненного взятия материала из организма до начала фиксации. Этот срок должен быть максимально со­кращен, желательно до нескольких минут, хотя неплохая мор­фологическая сохранность, достаточная для идентификации ткани, клеток и веществ с целью патоморфологической диагностики, может быть обеспечена при фиксации материала через 30 — 90 мин после операции.

Температура фиксирующего раствора для гистохимических целей в большинстве случаев устанавливается от 0 до 4 °С для замедления аутолитических процессов и для снижения скорости возможной диффузии исследуемого вещества. Фиксация на холоду особенно рекомендуется для энзимогистохимических и ультрацитохимических исследований.

В химической фиксации для гистохимических целей используют в первую очередь альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид и др.), тетраоксид осмия, хромовую кислоту и ее соли, спирты (этанол, метанол и др.), ацетон, соли ртути (например, сулема), уранилацетат и кислоты (например, уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная и др.).

Формальдегид и смеси с формальдегидом

Фиксатор, наиболее широко используемый как в гистологии, так и в гистохимии,— формальдегид. Это газ, растворимый в воде до концентрации 40 % по массе; именно в такой концент­рации он и поступает в продажу под названием «формалин». В гистологической практике обычно используют 10 % раст­вор формалина, что соответствует 4 % раствору формальде­гида.

В водных незабуференных растворах формальдегид со вре­менем превращается в муравьиную кислоту, метиловый спирт и ацетон, которые существенно ухудшают качество фиксации, особенно для гистохимии, электронной микроскопии. К недо­статкам формальдегида относится также его довольно высокая способность к полимеризации и выпадению белого осадка пара-формальдегида. В результате этих процессов точную концент­рацию формальдегида в растворах формалина установить не представляется возможным.

Формальдегид и смеси с формальдегидом можно использо­вать в большинстве гистохимических исследований. Особенно хорошо зарекомендовали себя при выявлении ферментов, глав­ным образом гидролитических и липидов, кальций-формол по Бейкеру, а для выявления нуклеиновых кислот фиксатор ФСУ (формалин — спирт — уксусная кислота).

Продолжительность фиксации 24 ч при комнатной температуре, 2-3 дня при 4 °С, 

10-14 дней при -25 °С.

Для фиксации гликогена наряду с известным фиксатором Буэна используют раствор Жандра, в котором к формалину, помимо пикриновой и уксусной кислот, добавлен этанол.

В рутинной электронной микроскопии и электронно-микроскопической гистохимии формальдегидные фиксирующие смеси проявили себя вначале не с лучшей стороны, что было обусловлено наличием в формальдегиде вредных примесей, главным образом метанола (до 16 %). Свободный от метанола формалин, полученный из параформальдегида, обеспечивает практически такую же ультраструктурную сохранность клеток, как и глутаровый альдегид, поэтому его с успехом применяют для многих гистохимических реакций.

Метод приготовления свободного от метанола 4 % раствора формальдегида из параформальдегида по Гайеру: 

Метод приготовления свободного от метанола 40 % раствора формальдегида из параформальдегида по Глауэрт: готовят 40 % раствор параформальдегида, растворяя 40 г порошка формальдегида в 100 мл дважды дистиллированной воды при нагревании до 65С, постоянно помешивая. Добавляют не­сколько капель 40 % гидроксида натрия до просветления рас­твора. Полученный раствор 40 % параформальдегида охлажда­ют перед смешиванием с другими компонентами фиксирующей смеси.

Главным преимуществом формальдегида по сравнению с глутаровым альдегидом и тетраоксидом осмия является его более высокая проникающая способность. Однако его взаимодействие с белками идет медленно и, что не следует забывать, процесс обратим. Следовательно, длительное отмывание кусочков от формальдегидного фиксатора нежелательно.

==========================================================================

Глутаровый альдегид

Глутаровый альдегид обеспечивает наилучшую морфологическую сохранность и стабилизацию многих ферментов, поэтому его наиболее часто используют в электронной микроскопии и ультрацитохимических исследованиях ферментов.

Глутаровый альдегид не защищает липиды от последующего вымывания, и если не провести дофиксации в тетраоксиде осмия, то до 95 % липидов вымывается спиртами и/или ацето­ном в процессе обезвоживания материала.

Некоторые авторы рекомендуют использовать лишь свежие фиксирующие альдегидные смеси, хотя из практики известно, что они хорошо сохраняются в холодильнике в течение несколь­ких месяцев; в таких случаях необходимо лишь контролировать рН раствора.

==========================================================================

Тетраоксид осмия

Тетраоксид осмия — дорогой реагент. 

Он поступает в продажу в запаянных стеклянных ампулах по 0,5-2 г. Для получения водных растворов тетраоксида осмия чисто вымытую ампулу обертывают чистой плотной бумагой, раздавливают щипцами или молотком, вместе с осколками стекла помещают в дистиллированную воду нужного объема и выдерживают не менее 24 ч, так как он плохо растворяется в воде. Соблюдение чистоты при этой операции и хранение в чистой посуде позволяют сохранить водные 1-4 % растворы в течение многих месяцев даже при комнатной температуре. При этом флакон с раствором необходимо закрыть хорошо притертой пробкой и хранить в темноте. 

Для первичной фиксации липидов используют 1 % раствор тетраоксида осмия на 0,1 М фосфатном буфере, а также в смеси с хромовой или уксусной кислотой.

Раствор тетраоксида осмия 2 % готовят не менее чем за 1 сут; для лучшей сохранности липидов добавляют хлорид кальция или магния до конечной концентрации 1 — 3 ммоль. Если смесь используют для первичной фиксации, то вместо сахарозы добавляют хлорид натрия.

В этом растворе можно фиксировать блоки тканей толщиной не более 2 мм в течение 12 — 24 ч. Промывают 12 ч в воде и перед обезвоживанием выдерживают в течение нескольких ча­сов в 70 % спирте. Смешивать три компонента раствора Флемминга следует непосредственно перед использованием.

Для приготовления фиксирующего раствора 2 части жидкости Марчи (2,5 г бихромата калия, 1 г сульфата натрия и 100 мл дистиллированной воды), приготовленной непосредственно перед использованием, смешивают с 1 частью 1 % раствора тетраоксида осмия.

Прекрасная морфологическая сохранность клеток при осмиевой фиксации, в том числе и на ультраструктурном уровне, объясняется главным образом воздействием на белки, которые при этом не коагулируют, а желатинизируются, что практичес­ки не сопровождается сморщиванием ткани.

Тетраоксид осмия реагирует не только с аминогруппами, главным образом триптофана, цистеина и гистидина, но и с этиленовыми группами ненасыщенных липидов, которые восстанавливают его с образованием осмиевой черни. Благодаря этому тетраоксид осмия действует не только как фиксатор, но и как контрастирующее вещество, в связи с чем он нашел широкое применение в электронной микроскопии. Это свойство в последние годы стало играть большую роль в электронной гистохимии при использовании 3,3'-диаминобензидина, превращающегося в гистохимических реакциях в процессе окислительной полимеризации в избирательно осмирующийся продукт.

В электронной микроскопии тетраоксид осмия используют преимущественно для вторичной фиксации (или постфиксации) после первичной фиксации (или префиксации) в растворах альдегидов. Осмиевая постфиксация уменьшает потери липидов при последующих обезвоживании и заливке в смолы. При этом не только липидные структуры, но также клеточный матрикс, митохондрии и клеточные мембраны лучше контрастируются.

Хорошего контрастирования клеточных структур можно достичь также путем постфиксации в 1 % растворе тетраоксида осмия с 1,5 % гексацианоферратом (феррицианидом) калия на 0,1 М фосфатном буфере:

Продолжительность постфиксации 2 ч при комнатной температуре.

Этот вариант постфиксации рекомендуется как для морфологических, так и особенно для электронно-микроскопических гистохимических исследований, поскольку достигаемый при этом «мягкий» контраст не маскирует продукт гистохимической реакции и позволяет не проводить дополнительное контрастирование цитратом свинца по Рейнольдсу.

==========================================================================

Хромовая кислота и хроматы

Хроматы дают нерастворимые соединения с белками и липидами, образуют комплексы с водой. Такие комплексы, подобно формальдегиду, могут образовывать связи с реакционноспособными группами белков, что и оказывает фиксирующий эффект. Хроматы могут быть также использованы для стабилизации липидов благодаря их способности окислять ненасыщенные жирные кислоты. Их можно применять для фиксации гликогена и нуклеиновых кислот.

Наиболее часто используют фиксатор Элфтмана (бихромат-сулема), 

содержащий 2,5 % бихромат калия и 5 % сулему:

Продолжительность фиксации 3 дня при комнатной температуре.

==========================================================================

Кислоты

Чистые кислоты для фиксации биологических объектов используются реже. Однако благодаря своему более быстрому проникновению в ткань по сравнению с другими компонентами фиксирующей смеси они оказывают смягчающее действие и таким образом препятствуют сморщиванию ткани, воздействуя в процес­се гидролиза на гетерополярные валентные связи и ослабляя состояние гидратации.

Кислоты (пикриновая, уксусная, трихлоруксусная, азотная) входят в различных сочетаниях с формальдегидом и спиртом во многие известные фиксирующие смеси (по Буэну, Жандру, Карнуа, Лилли, Ценкеру, Бродскому и др.), используемые для фиксации нуклеопротеидов, полисахаридов, а также простейших и сперматозоидов. Кроме того, азотная, муравьиная и трихлоруксусная кислоты входят в различные сочетания с формальдегидом и спиртом в состав декальцинирующих смесей. S. Ito и M.J. Karnovsky (1968) получили более полную сохранность химических компонентов и антигенных структур, используя смеси формальдегида и глутарового альдегида с пикриновой кислотой (тринитрофенол) и другими соединениями с тремя нитрогруппами.

==========================================================================

Спирты и ацетон

Спирты и ацетон наиболее часто используют для осаждения белков. Они одновременно обезвоживают и уплотняют ткань. При длительном выдерживании ткани в абсолютных спиртах и ацетоне ткань становится настолько плотной, что приготовление срезов практически невозможно. Спирты и ацетон обеспечивают хорошую морфологическую сохранность бактерий, фибрина, эластических волокон и мазков клеток.

В гистохимии, как и в гистологии, спирты и ацетон используют не только как фиксирующие, но и как обезвоживающие агенты. В гистохимических исследованиях их применяют в чистом виде при фиксации многих окислительно-восстановительных ферментов, однако при этом подавляется активность ряда фосфогидролаз. Спирты и ацетон используют также в различных сочетаниях с кислотами, солями металлов и альдегидами для фиксации нуклеопротеидов и полисахаридов. Фиксация 0,65 % раствором хлорида магния в безводном ацетоне обеспечивает хорошую сохранность фосфолипидов [Бухвалов И.Б., 1969].

Фиксация и одновременное обезвоживание проводятся при комнатной температуре в двух сменах фиксатора по 60 мин.