|
ГИСТОХИМИЯ ПИГМЕНТОВ
Термин «пигменты» охватывает группу веществ, поглощающих свет в видимом спектре и наблюдаемых в неокрашенных клетках и тканях. Под это определение подходят вещества различного происхождения, состава и функционального назначения. По происхождению пигменты можно разделить на экзогенные (в частности, угольная или известковая пыль, отложения металлов, химиотерапевтических веществ и др.) и эндогенные. Эндогенные пигменты разделяют на гематогенные (например, гемоглобин и его производные) и негематогенные, или аутогенные (например, меланин и жировые пигменты — липофусцины и каротиноиды).
В гистохимическом отношении пигменты мало различаются. Несмотря на то, что химический состав ряда пигментов выяснен не до конца, гистохимически их можно выявить с достаточно высокой степенью надежности, тем более что большинство из них имеет характерную тканевую локализацию.
Выявление гемосидерина и гемоглобина
Гемосидерин — железосодержащий пигмент, образующийся из гемоглобина в результате внутриклеточных превращений.
Для выявления гемоглобина пригодна реакция псевдопероксидазы с бензидином, а идентификация гемосидерина основана на определении содержащегося в нем железа с помощью реакции Перлса с кислым ферроцианидом.
Кроме того, гемосидерин дает положительную ШИК-реакцию, обусловленную его нахождением в белково-полисахаридном комплексе. Резко положительна реакция этого комплекса с тетразолием после бензотирования.
Выявление гемоглобина бензидином по Пикворту
1. Материал фиксируют в формалине, заливают в парафин.
2. Депарафинированные срезы доводят до воды.
3. Промывают в метаноле.
4. Перевернутое стекло со срезом помещают в раствор бензидина (0,2 г бензидина и маленький кристаллик нитропруссида натрия растворяют в 15 мл метанола, добавляют 4 капли ледяной уксусной кислоты и встряхивают) в чашке для окрашивания на 5-10 мин.
5. Смывают бензидин озонированным эфиром (50 мл 3 % перекиси водорода, 100 мл метанола и 50 мл эфира).
6. Помещают срез на 10 мин в свежую порцию озонированного эфира.
7. Промывают в проточной воде 10-15 мин.
8. Докрашивают ядра в 1% водном растворе нейтрального красного 3 мин.
9. Промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в дистрен-дибутил-ксилол.
Результат:
гемоглобин и некоторые «оксидазные» гранулы лейкоцитов окрашиваются в темно-синий цвет, ядра — в красный.
-----------------------------------------------------------------------------------------------
Трехцветный метод выявления билирубина, гемосидерина и липофусцина
по Гпеннеру
1. Срезы толщиной 10 мкм готовят в криостате, наклеивают на стекла и подсушивают при комнатной температуре.
2. Погружают на 5 мин в 2 % раствор гексацианоферрата калия.
3. Обрабатывают 20 мин свежеприготовленной смесью равных частей 2 % гексацианоферрата калия и 5 % уксусной кислоты.
4. Ополаскивают в проточной воде и обрабатывают в течение 15 мин 3 % раствором бихромата калия с рН 2,2.
5. Промывают в воде.
6. Окрашивают свежепрофильтрованным раствором жирового красного-О в изопропаноле 20мин.
7. Промывают в проточной воде в течение 5 мин.
8. Заключают в сироп Апати.
Результат:
липофусцины окрашиваются в оранжево-красный цвет,
гемосидерин — в синий,
билирубин — в темный изумрудно-зеленый.
Примечание.
Гемосидерин растворяется в кислотах, поэтому для его выявления не следует применять кислые фиксаторы .
Выявление желчных пигментов
Желчные пигменты, как и гемосидерин, являются продуктом разложения гемоглобина и других железосодержащих белков. Основные желчные пигменты — билирубин и биливердин — обладают кислотными свойствами и образуют со щелочноземельными металлами соли, не растворимые в воде. Их идентификация возможна с помощью окраски метиленовым синим, реакций Гмелина и Штейна. Реакция Гмелина основана на окислении билирубина азотной кислотой, а реакция Штейна — на окислении его йодом. Метод Штейна позволяет выявить все желчные пигменты.
Реакция с йодом на желчные пигменты по Штейну
1. Материал фиксируют в формалине или спирте, заливают в парафин.
2. Депарафинированные срезы доводят до воды.
3. Обрабатывают 12 — 18 ч йодным реактивом
(2 части раствора Люголя и 1 часть 10 % раствора йода на 96 % спирте).
4. Промывают в проточной воде 5 мин.
5. Обесцвечивают 5 % раствором тиосульфата натрия 30 с.
6. Промывают и докрашивают квасцовым кармином Майера 3-18 ч.
7. Промывают в воде, обезвоживают абсолютным ацетоном, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.
Результат:
желчные пигменты окрашиваются в темно-зеленый цвет,
ядра—в красный.
Выявление меланина
Меланин имеет сложную полимерную структуру и обычно окрашен в черно-коричневый цвет, хотя имеются и другие оттенки — до желтого и даже фиолетового. Как правило, он встречается в форме гранул — меланосом — в клетках тканей эктодермального происхождения — в эпидермисе, волосах, волосяных фолликулах, меланомах кожи, пигментном эпителии радужки, сетчатке. В нервной системе присутствует разновидность меланина — нейромеланин.
Меланин синтезируется в промеланосомах через окисление тирозина до ДОФА при участии тирозиназы и пероксидазы. На этом основаны методы специфического контрастирования и электронно-микроскопического гистохимического выявления промеланосом по положительной реакции на тирозиназу.
Выявление меланина основано на его способности образовывать комплексы с ионами двухвалентного железа, которые легко обнаруживаются гексацианоферратом калия в реакции турнбулевой сини. На этом принципе основан метод Лилли.
«Железный» метод выявления меланина
по Лилли
1. Материал фиксируют в различных смесях, заливают в парафин.
2. Депарафинированные срезы доводят до воды.
3. Помещают в 2,5 % раствор сульфата железа гептагидрата на 60 мин.
4. Промывают в 4 сменах дистиллированной воды по 5 мин.
5. Помещают в 1 % раствор гексацианоферрита (III) калия в 1 % уксусной кислоте на 30 мин.
6. Промывают в 1 % уксусной кислоте.
7. При желании докрашивают пикрофуксином по Ван-Гизону.
8. Проводят через спирт возрастающей концентрации и ксилол, заключают в бальзам.
Результат:
меланин окрашивается в темно-зеленый цвет на бесцветном фоне; такой же цвет имеет гемосидерин.
Меланин, как и липофусцин, обладает способностью восстанавливать раствор аммиачного серебра. На этом основан принцип электронно-микроскопического гистохимического выявления промеланосом и меланосом по Мисиме. Раздельное выявление меланина и липофусцина возможно по их разному окрашиванию нильским синим. Кроме того, липофусцин в отличие от меланина дает видимую собственную флюоресценцию в ультрафиолетовом свете.
Импрегнация серебром промеланосом и меланосом
по Мисиме
1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в 10 % формальдегиде на фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 1 ч при 4 "С.
2. Тщательно промывают в дистиллированной воде.
3. Инкубируют в растворе аммиачного серебра 40 — 60 мин при 58 °С.
4. Промывают в нескольких сменах дистиллированной воды.
5. Кусочки ткани помещают на 1 —2 мин в раствор трихлорида золота (5 мл 6 % тиосульфата натрия смешивают с 5 мл 6 % тиоцианата аммония и добавляют по каплям 2 % раствор трихлорида золота до образования розовато-красного осадка).
6. Кусочки ткани помещают сразу в 0,6 % раствор тиосульфата натрия на 8 мин.
7. Тщательно промывают в дистиллированной воде.
8. Дополнительно фиксируют в 0,6 % забуференном растворе перманганата калия или в 1 % забуференном растворе тетраоксида осмия (рН 7,4) 1 ч при 4 "С.
9. Обезвоживают и заливают.
Результат:
серебрятся меланосомы и премеланосомы.
Гранулярные отложения металлического серебра выявляются и в тех премеланосомах, в которых меланин не образуется (у альбиносов).
Выявление липофусцина и меланина с применением нильского синего
по Лилли
1. Материал фиксируют в любом фиксаторе, заливают в парафин.
2. Депарафинированные среды доводят до воды.
3. Окрашивают в течение 20 мин 0,05 % раствором нильского синего А в 1 % серной кислоте.
4. Промывают в проточной воде 10 — 20 мин.
5. Можно также быстро ополоснуть в 1 % растворе серной кислоты и обезводить в 4 порциях абсолютного ацетона.
6. Заключают после п. 3 в глицерин-желатин или после п. 4 проводят через ксилол и заключают в синтетическую среду.
Результат:
если обработка включала пп. 4 и 6, то липофусцины окрашиваются в темно-синий или зеленый цвет, меланин -в темно-зеленый; при обработке с включением пп. 5 и б меланин окрашивается в темно-зеленый цвет, а липофусцины сохраняют свою первоначальную окраску.
Метод дифференцировки меланина от липофусцина
по Хуэку
1. Материал фиксируют в любом фиксаторе, заливают в парафин.
2. Депарафинированные срезы помещают в дистиллированную воду.
3. Срезы окрашивают свежеприготовленным насыщенным водным раствором нильского синего 30мин.
4. Промывают в дистиллированной воде.
5. Обесцвечивают 10 % перекисью водорода 24 ч.
6. Промывают в проточной воде.
7. Заключают в глицерин-желатин.
Результат:
липофусцин окрашивается в синий цвет,
меланин в результате обработки перекисью водорода обесцвечивается.
Выявление жировых пигментов
Наряду с липофусцином к жировым пигментам относятся гемофусцин, цероид, псевдомеланин, железосодержащие липопигменты и каротиноиды.
Липофусцин обладает выраженной базофилией и сильной восстанавливающей способностью, на чем основана реакция Шморля - основная реакция на липофусцин. Липофусцин окрашивается также нильским синим.
Выявление кислотоустойчивых липофусцинов
по Цилю—Нильсену
1. Материал фиксируют в различных смесях, заливают в парафин.
2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды.
3. Окрашивают срезы в течение 3 ч при 60 °С в растворе карбол-фуксина (10 г основного фуксина + 50 г фенола + 100 мл спирта + 1000 мл дистиллированной воды).
4. Промывают в проточной воде.
5. Дифференцируют в 1 % солянокислом спирте до тех пор, пока эритроциты не станут розовыми.
6. Промывают в дистиллированной воде.
7. Докрашивают в железных квасцах или 0,5 % растворе
толуидинового синего.
8. Промывают в проточной воде.
9. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам.
Результат:
кислотоустойчивые липофусцины окрашиваются в ярко-красный цвет, а липопротеиды приобретают красноватый оттенок; ядра окрашиваются в темно-синий или синий цвет.
Примечание.
Из-за базофилии липофусцинов слишком сильная докраска обусловливает развитие темно-красного окрашивания.
В присутствии фенола растворимость красителей в липидах повышается.
Метод Шморля для выявления липофусцина
1. Материал фиксируют в формалине, заливают в парафин или получают срезы на замораживающем микротоме.
2. Срезы промывают в дистиллированной воде.
3. Помещают срезы на 5 — 20 мин в реакционную смесь
[3 части 1 % раствора дихлорида железа смешивают с 1 частью 1 % раствора гексацианоферрата (III) калия; смесь используют в течение 30 мин после приготовления].
4. Срезы хорошо промывают в проточной воде.
В особенно важных случаях рекомендуется проводить микроскопию срезов, заключенных в воду.
5. Быстро обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам.
Результат:
липофусцин и меланин окрашиваются в темно-синий цвет.
Кроме того, положительную реакцию дают аргентаффинные гранулы, а также ткани, содержащие активные SH-группы.
Примечание.
После п. 4 можно провести окрашивание ядер 1 % нейтральным красным в течение 3 мин.
| 
