ГИСТОХИМИЯ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ

В связи с исключительно важной биологической ролью нуклеопротеидов в белковом синтезе и генетических механизмах необходимо их отдельное рассмотрение. Нуклеопротеиды состоят из белкового компонента, в котором преобладают основные белки типа гистонов и протаминов, и небелкового компонента, или простетической группы — нуклеиновой кислоты.

В тканях животных и растений, а также в микроорганизмах встречаются два типа нуклеиновых кислот — дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК),представляющие собой высокополимерные молекулы полинуклеидов, образованные из мононуклеотидов. Каждый мононуклеотид состоит из пентозы (дезоксирибозы или рибозы), орто-фосфорной кислоты и пуринового или пиримидинового основа­ния. Пентоза связана диэфирной связью с фосфорной кислотой и гликозидной — с основанием. 

Мононуклеотиды объединены в полинуклеотидную цепочку через фосфатную группу.

В ДНК пентоза представлена дезоксирибозой, пуриновые основания — аденином и гуанидином, а пиримидиновые основания — тимином и цитозином. В РНК пентоза находится в виде рибозы, а тимин замещен урацилом. Различия по тимину и урацилу позволяют проводить дифференцированное радиоавтографическое изучение ДНК и РНК с соответствующим радиоактивным предшественником тимидином для ДНК и уридином для РНК. Другое важное различие — спиральная двухцепочечная структура и значительно большая молекулярная масса (1-8 млн) у ДНК по сравнению с РНК, имеющей, как правило, одиночную цепь и существенно меньшую степень полимеризации,— обусловливает их различное окрашивание основными красителями — метиловым зеленым и пиронином.

Гистохимическое выявление нуклеиновой кислоты может быть направлено на любой из трех ее компонентов: 

1) пуриновые и пиримидиновые основания выявляют по поглощению ультрафиолетового излучения; 

2) углеводный компонент определяют по образующимся в результате кислотного гидролиза альдегидным группам с помощью реактива Шиффа или его аналогов; 

3) фосфорную кислоту выявляют по сродству к основным красителям. Кроме того, разработаны и обоснованы методы ферментативной и химической экстракции нуклеиновых кислот, повышающие надежность и специфичность гистохимических методов.

Выявление пуриновых и пиримидиновых оснований

Гетероциклические кольца пуриновых и пиримидиновых оснований ДНК и РНК специфически поглощают ультрафиолетовое излучение при длине волны 260 нм. Количественную оценку содержания нуклеиновых кислот проводят по оптической плотности при указанной длине волны. Дифференцированное выявление ДНК и РНК на основании различий в поглощении ультрафиолетового излучения осуществляют с помощью специфического экстрагирования ДНК- и РНК-азой.

----------------------------------------------------------------------------------

Выявление углеводного компонента ДНК по Фельгену

Принцип этого метода выявления ДНК заключается в том, что в результате мягкого гидролиза под влиянием 1 н. соляной кисло­ты в фиксированных препаратах происходит специфическое отщепление от ДНК пуриновых оснований (аденина и гуанидина), связанных с С-атомом дезоксирибозы. Удаление пуриновых оснований раскрывает потенциальные альдегидные группы, которые после этого способны реагировать с реактивом Шиффа и образовывать кислотостойкий краситель красно-фиолетового цвета. Образовавшийся окрашенный комплекс очень стабилен. Фуксин может быть экстрагирован из соединения только после обработки горячими кислотами или щелочами.

Метод Фельгена прост и надежен, но условия кислотного гидролиза играют в нем решающую роль. Продолжительный гидролиз приводит к ослаблению окрашивания, причиной которого может быть деполимеризация и экстрагирование ДНК, а также химические изменения. Оптимальная продолжительность кислотного гидролиза 1 н. соляной кислотой при 60 "С определяется выбором фиксатора.

При обследовании указанных условий гидролиза РНК практически полностью вымывается из срезов, поэтому не происходит образования альдегидов из рибозы и при правильном прове­дении реакции Фельгена РНК всегда остается неокрашенной.

Стандартная реакция Фельгена

=======================================================

1. Материал фиксируют одним из перечисленных фиксаторов, заливают в парафин или готовят мазки суспензированных клеток.

2. Срезы депарафинируют и через ряд спиртов убывающей концентрации доводят до воды.

3. Быстро промывают в холодной 1 н. соляной кислоте.

4. Помещают при 60 °С в 1 н. соляную кислоту на оптимальное время гидролиза (от8 до22 мин). Хорошие результаты дает также гидролиз в 5 н. соляной кислоте при 37 °С.

5. Быстро промывают в 1 н. соляной кислоте, затем в дистиллированной воде.

6. Переносят в реактив Шиффа на 45 мин.

7. Промывают в 3 сменах свежей смеси, состоящей из 5 мл 10 % пиросульфита калия, 5 мл 1 н. соляной кислоты, дистиллированной воды до 100 мл) по 2 мин в каждой.

8. Промывают в дистиллированной воде 2 мин.

9. Возможна докраска 1 % водным раствором светло-зеленого (1 мин) или 0,5 % спиртовым раствором прочного зеленого 1 мин.

10. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Результат: 

структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в красно-лиловый цвет. 

После обработки дезоксирибонуклеазой реакция отрицательна.

----------------------------------------------------------------------------------------------------

Приготовление реактива Шиффа. 

Существуют различные способы приготовления реактива Шиффа. Состав реактива (содержание фуксина, кислотность, насыщение сернистым газом) оказывает выраженное влияние на реакцию с альдегидами, причем не все партии фуксина удовлетворительного качества. Готовый реактив следует хранить в холодильнике в полностью заполненном сосуде с хорошо притертой пробкой. Реактив может сохраняться в течение нескольких месяцев и внезапно терять красящие свойства. Слабая розовая окраска реактива не влияет на его специфичность и может быть устранена с помощью активированного угля.

1.Метод ди Томаси

Растворяют 1 г основного фуксина в 200 мл кипящей дистиллированной воды. 

Охлаждают до 52 °С. Фильтруют и добавляют 1 г пиросульфита натрия или калия. 

После выдерживания раствора в темноте 16 — 24 ч, до­бавляют 2 г активированного угля, встряхивают и фильтруют в сосуд для хранения.

2. Метод Итакавы и Огуры. 

Растворяют 1 г основного фуксина в 200 мл кипящей воды. 

Охлаждают и фильтруют через пористый стеклянный фильтр, в раствор пропускают сернистый ангидрид (свежегенерированный или из газового баллона). После того как красный раствор станет прозрачным, сосуд закрывают пробкой и оставляют на ночь при комнатной температуре. Добавляют 500 мг активированного угля, хорошо встряхивают и фильтруют.

3. Метод Элфтмана (модификация «холодного» метода Лилли). 

Добавляют 1 г основного фуксина и 2 г гидросульфита натрия к 100 мл 0,2 н. соляной кислоты в колбу на 150 мл. 

Встряхивают 2 ч, добавляют 500 мг активированного угля, хорошо встряхивают и фильтруют.

Окрашенные по методу Фельгена препараты можно хранить бесконечно долго, выцветание их незначительное: согласно результатам цитоспектрофотометрии, 3-4 % за 1-й год хранения. Продукт реакции Фельгена удовлетворяет требованиям закона Ламберта-Бера, что позволяет проводить цитоспектрофотометрический анализ препаратов. 

Абсорбционный максимум красителя составляет 585 нм.

Несмотря на сравнительную простоту метода Фельгена и надежность современной техники для цитоспектрофотометрии, могут быть получены ошибочные данные об уменьшении содержания ДНК в ядрах клеток опухолей вплоть до появления гаплоидного класса клеток. Такие ошибки исключаются при цитофотометрировании не гистологического препарата, а мазков из суспензированной ткани.

 -----------------------------------------------------------------------------------------------

Реакция выявления фосфорной кислоты 

основными красителями

Основные, или катионные, красители обладают свойством более или менее избирательно связываться с отрицательно заряженными кислотными группами. Эти реакции не строгоспецифичны к фосфатным группам нуклеиновых кислот, поэтому необходим контроль (блокирование, а также химическая или ферментативная экстракция).

В гистохимии нуклеиновых кислот используют красители тиазинового или оксазинового ряда, например тионин.

Для тиозиновых красителей характерно наличие тиазониевого катиона с выровненными связями (заряд равномерно распределен между атомами серы и азота), поэтому цвет катиона тиозиновых красителей от голубого до синего. Широко известный метиленовый синий является тетраметильным производным тионина. При рН от 3,0 до 5,0 он окрашивает не только нуклеиновые кислоты, но и кислые гликозаминогликаны. Их можно дифференцировать в контрольных опытах с нуклеазами. К тиазиновым красителям относятся толуидиновый синий, который связывается с ДНК при рН 4,0 —6,0 в стехиометрических соотношениях, и крезиловый фиолетовый, связывающийся с РНК при рН 4,2 стехиометрически, поэтому может быть использован для цитофотометрического определения содержания РНК.

----------------------------------------------------------------------------------------------

Окраска комплексом галлоцианин-хромовые квасцы

Принадлежащий к оксазиновым красителям галлоцианин в водных растворах существует в виде катиона и может образовывать комплексы с металлами (в частности, с хромом), специфически связывающиеся с нуклеиновыми кислотами.

С помощью цитофотометрических исследований установлено, что при выявлении РНК и ДНК каждый их мононуклеотид через фосфатную группу связывается с одним катионом красителя. 

В результате этой реакции РНК и ДНК окрашиваются в серо-голубой цвет. При рН от 1,5 до 1,7 специфичность связывания красителя с нуклеиновыми кислотами довольно высока. Поскольку краситель связывается с субстратом в стехиометрических соотношениях, этот метод может быть использован в количественных цитофотометрических исследованиях.

----------------------------------------------------------------------------------------------

Выявление ДНК и РНК смесью галлоцианина и хромовых квасцов

1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в жидкости Карнуа или спирте в течение 2-4 ч при температуре 2-4 °С и заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы проводят через спирты убывающей концентрации до воды.

3. Помещают на 24-48 ч при комнатной температуре в раствор смеси галлоцианина и хромовых квасцов.

0,15 г галлоцианина кипятят в 10 мл 5 % раствора хромовых квасцов; после охлаждения фильтруют и доводят дистиллированной водой до 100 мл; рН красящего раствора доводят до 1,64 (можно 1 н. соляной кислотой).

4. Дифференцируют в дистиллированной воде, спиртах возрастающей концентрации, заключают в бальзам.

Результат: 

ядра и цитоплазматические структуры, содержа­щие РНК (например, тельца Ниссля в нервных клетках), окрашиваются в темно-синий или черный цвет.

Примечание. Продолжительность окрашивания можно уменьшить (правда, при одновременном усилении неспецифи­ческого окрашивания) путем повышения температуры (44 — 56 °С) до 4 ч. Смесь галлоцианина с хромовыми квасцами можно также использовать для докрашивания ядер при радиоавтографии.

----------------------------------------------------------------------------------------------

Окраска ДНК и РНК метиловым зеленым-пиронином 

по Браше в модификации Курника

1. Материал фиксируют в 10 % нейтральном формальдегиде 4-12 ч или жидкости Карнуа 4-24 ч при 4 °С; заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды.

3. Окрашивают срезы в смеси метилового зеленого-пиронина (12,5 мл 2 % пиронина GS + 7,5 мл 2 % метилового зеленого + 30 мл дистиллированной воды) 6 мин при температуре 18-24 °С.

4. Просушивают фильтровальной бумагой.

5. Дифференцируют в 2 сменах н-бутанола по 5 мин.

6. Просветляют в 3 сменах ксилола по 5 мин.

7. Заключают в бальзам.

Результат: 

структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в голубовато-зеленый цвет, а содержащие РНК - в красный.

Контроль. 

Предварительная обработка срезов рибонуклеазой или деоксирибонуклеазой; в зависимости от фермента остаются неокрашенными участки, в которых локализуются РНК или ДНК.

Примечание. 

Метиловый зеленый обычно содержит примесь метилового фиолетового, который перед использованием рекомендуется удалять с помощью экстракции в хлороформе, лучше всего путем встряхивания в делительной воронке. При оценке содержания РНК в клетке следует учитывать, что пиронин частично экстрагируется из срезов при промывании и обезвоживании.

----------------------------------------------------------------------------------------------

Метод регрессивного контрастирования 

рибонуклеопротеидов по Бернару

В основе этого метода лежит дифференцирование с помощью комплексообразователей-ЭДТА или цитрата. Согласно К. Вегпаг, ультратонкие срезы для электронной микроскопии контрастируют водным раствором уранилацетата, а затем обрабатывают в ЭДТА или цитратном буфере, в результате чего ионы уранила вымываются из хроматина гораздо быстрее, чем из рибонуклеопротеинов (РНП). В предварительных опытах отрабатывают такую продолжительность дифференцирования в ЭДТА, чтобы РНП в отличие от хроматина еще сохранили бы связанные ионы уранила и могли бы быть контрастированы цитратом свинца. 

Материал, фиксированный тетраоксидом осмия, для этой цели непригоден.

----------------------------------------------------------------------------------------------

Регрессивное контрастирование рибонуклепротеидов 

по Бернару в модификации Бурглена

Для приготовления раствора ЭДТА 7,44 г динатриевой соли ЭДТА помещают в 50 мл дистиллированной воды и ставят на магнитную мешалку. Медленно, по каплям, добавляют свежеприготовленный 1 н. гидроксид натрия до полного просветления раствора и доводят рН до 7,0. Добавляют дистиллированной воды до 100 мл. 

Раствор оставляют в течение 4 дней при 4°С. 

Его можно использовать в течение нескольких месяцев.

1. Ультратонкие срезы материала, фиксированного в альдегидных растворах и залитого в гликольметакрилат или эпон, на медных сеточках контрастируют 30 мин 5 % водным раствором уранилацетата при 37 °С.

2. Осторожно промывают дистиллированной водой.

3. Переносят в раствор ЭДТА на 5-15 мин.

4. Осторожно промывают дистиллированной водой.

5. Контрастируют цитратом свинца 5—10 мин.

6. Промывают дистиллированной водой.

Специфичность метода Бернара по отношению к РНП может быть повышена при использовании его в сочетании с экстракцией нуклеазами. Однако в большинстве случаев в этом нет необходимости, так как метод применяют главным образом для изучения РНП в ядре, где другие структуры, выявляемые этим способом, отсутствуют.

----------------------------------------------------------------------------------------------

Ферментативный и химический гидролиз нуклеопротеидов

Дальнейший анализ нуклеиновых кислот осуществляют посредством ферментативной или химической экстракции. Преимуществом нуклеаз по сравнению с другими агентами является высокая специфичность, однако эффективность их использования зависит от способа фиксации, заливочной среды и других фак­торов. Наиболее эффективно действие ДНК- и РНКазы на ткани, фиксированные в формальдегиде. После фиксации тетраоксидом осмия возможно переваривание РНКазой, но не ДНКазой. Ферментативное расщепление лучше проводить на замороженных срезах, но можно и в кусочках ткани, и на депарафинированных срезах. Для электронно-микроскопической гистохимии лучше использовать заливку в гликольметакрилат после фиксации в формальдегиде: при этом сохраняется как структура, так и чувствительность к действию РНК- и ДНКазы.

Для химического гидролиза ДНК и РНК используют хлорную, трихлоруксусную и соляную кислоты. Все нуклеиновые кислоты удаляют из срезов ткани путем обработки 5—10 % трихлоруксусной кислотой при 90 °С в течение 10 мин или 10 % перхлоруксусной кислотой при 70 °С в течение 20 — 30 мин. Для экстракции РНК рекомендуется использовать холодную 10 % хлорную кислоту (18 ч при 4 °С). Успех химической экстракции, особенно на ультратонких срезах, также зависит от способа фиксации, заливочной среды, толщины среза и т.д., поэтому в каждом случае следует находить оптимальные условия в предварительных опытах.