ГИСТОХИМИЯ УГЛЕВОДОВ

Биологическая роль углеводов многообразна. 

В организме они выполняют опорные и энергетические функции, некоторые углеводы являются составными частями биологически важных соединений (АТФ, циклической АМФ, нуклеиновых кислот, гепарина, витамина С и др.). Гликопротеиды как специфический компонент иммуноглобулинов играют важную роль в иммунных механизмах, определяя антигенную активность сывороточных и клеточных факторов. Кроме того, продукты расщепления углеводов используются для синтеза практически всех классов соединений в живой клетке.

Классификация углеводов

В живой клетке углеводы существуют в форме моно-, олиго- и полисахаридов. В гистологических препаратах они сохраняются практически только в виде полисахаридов: во всяком случае только полисахариды могут быть с достоверностью выявлены гистохимически. Правда, возможно также гистохимическое выявление глюкозы и витамина С.

Общепринятой классификации полисахаридов не существует. 

Для практических гистохимических целей достаточно разделить полисахариды на гомо- и гетерополисахариды.

Гомополисахариды построены из остатков молекул моносахаридов, главным образом пентозы и гексозы, соединенных между собой кислотными мостиками. Гомополисахаридами являются крахмал, инулин, клетчатка, гликоген. К ним с определенными оговорками можно также отнести хитин и полигалактуроновую кислоту.

Гетерополисахариды разделяют на гликозаминогликаны (ГАГ) и гликопротеины. К кислым гликозаминогликанам ГАГ относят гиалуроновую кислоту, молекула которой построена из остатков глюкуроновой и уксусной кислот и гексозамина; хондроинин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан-сульфат, кератан-сульфат, гепаритин-сульфат, гепарин, молекулы которых содержат остатки гексозамина, глюкуроновой или уроновой кислот, серной и уксусной кислот в различных сочетаниях. В тканях кислые ГАГ, кроме гепарина, находятся в соединении с белками. Такие комплексы, в которых к белковому стержню присоединены полисахаридные цепи, носят название «протеогликаны». Все эти соединения входят в состав матрикса соединительной ткани, крови, синовиальной жидкости, слизи.

Гликопротеины являются белками, к молекуле которых ковалентно присоединены олигосахариды: гексозы, гексозамины, сиаловые кислоты, фукозы и др. Такие соединения являются составной частью клеточных мембран, слизистых секретов желез, сывороточных белков, ферментов, гормонов, «неколлагеновых белков» соединительной ткани и т.д.

Гистохимическая идентификация углеводов

Выявление углеводов основано, как правило, на методах общего анализа химических групп. Используются методы окисления, метахроматическое окрашивание основными красителями, реакции связывания коллоидных металлов, выявление базофилии, окрашивание кармином, реакции блокирования и превращения реакционноспособных групп, методы ферментативного гидролиза, радиоавтографию, иммуногистохимию.

Методы окисления 1,2-гликолей до альдегидов

Реакция Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакция)

Метайодная кислота селективно окисляет и расщепляет -С=С-связи не только в 1,2-окси-, но также в 1-окси-2-амино-1-окси-2-алкиламино- и 1-окси-2-кетогруппах. 

В результате этого образуется одна кетогруппа или две альдегидные группы, как, например, в глюкозе. Альдегидные группы реагируют с реактивом Шиффа (фуксин-сернистой кислотой) точно так же, как и в реакции Фельгена. С помощью этого метода выявляют все соединения, содержащие оксигруппы, которые в результате окисления метайодной кислоты могут превращаться в альдегидные группы. Однако в гистологических срезах практически лишь гликоген и гликопротеины, сохраняющиеся в достаточных количествах, могут быть выявлены с помощью ШИК-реакции. Гликоген можно дифференцировать от гликопротеинов путем переваривания в амилазе или диастазе.

Для окисления -С-С-связей в полисахаридах предпринимались попытки использовать, помимо одной кислоты, другие окислители-хромовую кислоту, перманганат калия, тетраацетат натрия и т.д. Наиболее удачной является модификация ШИК-реакции, предложенная А.Л. Шабадашем (1949).

1. Материал фиксируют в 10 % формалине, жидкостях Карнуа, Ценкера, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллирован­ной воды.

3. При комнатной температуре срезы окисляют 0,5—1 % водным раствором орто- или метайодной кислоты в течение 2 —10 мин.

Окисление можно также проводить по Шабадашу в 0,001—0,01 М метаперйодате калия или натрия в течение 7 — 25 мин. 

Раствор хранят в темноте. 

Рабочую концентрацию этого раствора и продолжительность инкубации в ней подбирают в зависимости от объекта.

4. Промывают в дистиллированной воде 10 мин.

5. Помещают срезы в реактив Шиффа на 10-30 мин при комнатной температуре в темноте. 

-----------------------------------------------------------------------------------------

6. Срезы промывают сернистой водой (600 мл дистиллированной воды + 30 мл 10 % пиросульфита калия + 30 мл 1 н. со­ляной кислоты) три раза по 2 мин. 

Сернистую воду можно так­же готовить (непосредственно до проведения реакции) по рекомендации А.Л. Шабадаша следующим образом: 

к 200 мл дистиллированной воды добавить 10 мл 10 % раствора натрия гидросульфита 

и 10 мл 1 н. соляной кислоты.

7. Тщательно промывают в проточной и дистиллированной воде, ядра можно докрасить 0,5 % светлым зеленым или кислым гемалауном.

8. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, заключают в бальзам.

Результат: 

углеводы, содержащие гексозу, окрашиваются в красно-лиловый цвет, гликоген — в более интенсивный темно-красный.

Контроль: 

расщепление гликогена амилазой или диастазой, реакция ацетилирования для блокирования гидроксильных групп.

Примечание: 

необходимо пользоваться химически чистой посудой, стеклянными палочками; нельзя работать с металлическими крючками или иголками; окрашивание срезов в реактиве Шиффа следует проводить в темноте.

Метахроматическое окрашивание кислых гликозаминогликанов

Метахромазия — это изменение спектров поглощения используемых красителей. 

Метахромазию можно получить при использовании очень широкого набора красителей (табл. 2).

Пригодность красителя для выявления метахромазии определяется тем, насколько ортохроматический и метахроматический максимумы поглощения отдалены друг от друга.

В гистохимии под метахромазией подразумевают практически только явления, наблюдающиеся при использовании красителей тиазиновой группы, а именно те изменения окраски от синего через фиолетовый до красного, которые происходят при окрашивании тканей разбавленными водными растворами красителей названной группы.

Типичным примером метахромазии служит окрашивание тиазиновыми красителями (тионин, толуидиновый синий и т.п.) лаброцитов (тучных клеток), при котором гранулы этих клеток окрашиваются в фиолетово-красный цвет, тогда как другие структуры воспринимают оригинальный синий цвет красителя.

Метахроматическое окрашивание не связано ни с определенной химической структурой, ни с определенным химическим соединением, а обусловлено плотностью анионов на поверхности молекулы субстрата, а также степенью ионизации. Наличие метахромазии свидетельствует только о наличии некоторой минимальной плотности свободных отрицательных поверхностных зарядов на молекулах субстрата. В животной ткани метахроматически окрашиваются главным образом кислые ГАГ, характеризующиеся высокой молекулярной массой и большим количеством свободных анионных групп (R=0=SO-3, R-0=HPO-3, R=COO-).

Все приемы подготовки срезов и следующей за окрашиванием обработки влияют на метахромазию, поэтому предпочтительнее использовать криостатные срезы с непродолжительной последующей фиксацией. Окрашенные срезы перед обезвоживанием и заключением в бальзам рекомендуется предварительно просматривать в дистиллированной воде под покровным стеклом. Существуют также методы сохранения метахромазии в постоянных препаратах [Кутах Г.Н., Шубич М.Г., 1965].

Реакции связывания коллоидных металлов

Подобно основным (катионным) красителям, катионы некоторых металлов также образуют соединения с анионами кислых ГАГ. С этой целью используют коллоидные растворы золота, тория, платины, железа, а также ионы бария и висмута. Торий, платину, барий и висмут применяют главным образом для кон­трастирования кислых ГАГ в электронно-микроскопической гистохимии.

В светооптической гистохимии применяется в первую очередь метод Хэйла, основанный на связывании в кислой среде (рН < 2) коллоидных мицелл гидроксида железа (III) с карбоксильными и сульфоновыми группами кислых ГАГ и последующем выявлении связанного железа с помощью гексацианоферрата (ферроцианида) калия в реакции берлинской лазури. Нуклеиновые кислоты и белки также могут связывать коллоидный гидроксид железа, но при более высоких значениях рН.

Выявление кислых гликозаминогликанов с помощью 

коллоидного железа (модификация реакции Хэйла по Грауманну—Клаусу)

1. Материал фиксируют в забуференном 10 % формалине, жидкостях Карнуа, Жандра, спирт-формоле (лучше пользоваться безводными фиксаторами) и заливают в парафин; возможна обработка срезов без фиксации или криостатных срезов.

2. Срезы депарафинируют и через ряд спиртов убывающей концентрации доводят до дистиллированной воды. Обработку свежих криостатных срезов начинают с п. 3. Фиксированные срезы хорошо промывают в дистиллированной воде.

3. Помещают срезы на 10 мин в раствор коллоидного железа, подкисленного уксусной кислотой (маточного раствора 10 час­тей, 96-99 % уксусной кислоты 4 части). 

Маточный раствор: 

750 мл дистиллированной воды доводят до кипения и добавляют 12 мл 32 % раствора трихлорида железа. Образовавшийся гидроксид железа можно хранить в течение 1 мес.

4. Промывают в 2 сменах 5 % уксусной кислоты по 5 мин в каждой.

5. Срезы помещают в свежеприготовленный раствор, включающий 30 мл 2 % гексацианоферрата калия + 60 мл 1 % соляной кислоты на 10 мин.

6. Срезы проводят через 2 смены дистиллированной воды по 2 мин.

7. Обезвоживают в ряду спиртов возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Результат: 

структуры, в которых содержатся кислые ГАГ, окрашиваются в синий цвет.

Реакция Хэйла специфична для выявления свободных кислотных групп, например эфиров серной и фосфорной кислот, свободных гидроксильных групп уроновой и моноаминодикарбоновой кислот белков. Специфичность метода Хэйла для выявления кислых мукоидных веществ следует контролировать с помощью вспомогательных реакций. Ложную положительную реакцию, обусловленную присутствием железа в тканях, можно исключить путем обработки контрольных срезов в растворе гексацианоферрата калия и соляной кислоты (5-й этап данного метода).

Реакцию связывания железа можно комбинировать с ШИК-реакцией. 

В этом случае после п. 6 следует окисление метайод­ной кислотой. 

В результате этого кислые ГАГ окрашиваются в темно-синий цвет, белковые структуры — в светло-синий, а нейтральные гликопротеины — в красный цвет различных оттенков. Эта комбинация двух методов позволяет получить контрастную гистологическую картину при исследовании ткани почек и кожи.

Окраска альциановым синим

В гистохимической практике используют несколько фталоцианиновых красителей:

альциановые синие — 8 GX, 8 SX, 8 GS, 8 GN, 5 GX, 150,

альциановые зеленые — 2 GX, 3 ВХ, 

люксоловый прочный синий, астрасиний и др. 

Альциановый синий обладает большими преимуществами по сравнению с другими красителями кислых мукоидных веществ, прежде всего быстротой окрашивания и простотой применения. Прослеживается параллель между окрашиванием альциановым синим и метахромазией при изменении рН и концентрации красителя. На соответствующих объектах могут быть получены хорошие результаты в случае прижизненного окрашивания альциановым синим.

Окраска альциановым синим при рН 2,5

1. Материал фиксируют в формалине, формалин-этаноле, смесях Ценкера, Буэна, Карнуа и заливают в парафин (можно использовать криостатные срезы).

2. Депарафинированные срезы окрашивают в свежеотфильтрованном 

1 % растворе альцианового синего 8 GX в 3 % уксусной кислоте (рН 2,5) в течение 30 мин.

3. Промывают в проточной воде в течение 5 мин.

4. Обезвоживают в ряду спиртов возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Результат: 

слабокислые сульфатированные ГАГ (гиалуроновая кислота) и сиалогликопротеины приобретают темно-синюю окраску. 

Сильнокислые сульфатированные ГАГ окрашиваются слабо или совсем не окрашиваются.

Окраска альциановым синим при рН 1,0

1. Срезы помещают в дистиллированную воду.

2. Окрашивают в 1 % растворе альцианового синего 8 GX в 0,1 н. соляной кислоте (рН 1,0) в течение 30 мин.

3. Просушивают фильтровальной бумагой.

4. Обезвоживают в этаноле, проводят через ксилол, заклю­чают в бальзам.

Результат: 

окрашиваются только сульфатированные ГАГ.

Примечание. 

Вместо альцианового синего 8 GX можно использовать альциановый синий 8 GN, альциановый зеленый 3 ВХ или альциановый зеленый 2 GX. Для окрашивания очень кислых мукоидных веществ рекомендуется модификация окраски альциановым синим по Гомори.

Окраска метиленовым синим

Тиазиновый краситель метиленовый синий позволяет отделить кислые ГАГ от нейтральных гликопротеинов и дифференцировать сульфатные, фосфатные и карбоксильные группы путем выявления их базофилии при различных рН. Степень базофилии определяется наличием свободных анионов полисахаридов. По мере снижения рН интенсивность окрашивания отдельных структур снижается. Это явление носит название «экстинкция» (от лат. extinctio — гашение).

В присутствии электролитов, таких как соляная кислота, хлорид натрия и калия, окрашивание альциановым синим усиливается. При концентрациях хлорида магния ниже 0,3 М альциановый синий связывается кислыми ГАГ, содержащими сульфатированные и карбоксильные группы, а при концентрациях хлорида магния 0,8 М и выше окрашиваются исключительно вещества, содержащие S04-группы.. Эти факты свидетельствуют о ведущей роли электростатических сил при связывании альцианового синего с субстратом.

Для определения экстинкции метиленового синего можно использовать растворы 0,0005-0,005 М (приблизительно 0,1 — 0,01 %) метиленового синего в веронал ацетатном буфере или ацетатном буфере Михаэлиса при различных рН (от 2,6 до 8,0 с интервалами 0,5).

Наибольший интерес представляют значения рН ниже 4,0, так как анионные группы белков, прежде всего карбоксильные группы, значительно осложняющие интерпретацию результатов, теряют свой заряд. При рН 3,0 метиленовый синий связывается также нуклеиновыми кислотами, но для них характерна другая локализация, и их можно дифференцировать с помощью специфических реакций. Кроме того, их окрашивание можно ослабить путем добавления хлорида магния к раствору красителя. Вместо метиленового синего можно использовать растворы (0,02 %) азура А в HCl-фосфатном или фосфат-цитратном буфере.

К.С. Митин (1966) показал, что коллагеновые волокна не окрашиваются метиленовым синим при рН 5,0-6,0,а основное вещество средней оболочки аорты, построенное из хондроитин -сульфатов, обладает метахромазией при рН 2,5-3,0, интима обесцвечивается при рН 4,0, а лаброциты (тучные клетки) и нейроны окрашиваются в фиолетовый цвет при рН 1,5 — 2,0.

Окраска рутениевым красным

Рутениевый красный давно используют в световой микроскопии для окрашивания пектина, растительных муцинов, целлюлозы, крахмала, инулина и лигнина, гранул лаброцитов, основного вещества хряща и т.д. Специфичность этого окрашивания невысока, однако благодаря методу контрастирования рутениевым красным по Лафту значительно дополнены сведения о гликокаликсе-слое мукоидов, окружающих плазмалемму. При использовании этого метода на первом этапе образуется связь между катионом рутениевого красного и анионными группами кислых ГАГ, при этом субстрат окрашивается в красный цвет. Электронно-микроскопическое контрастирование происходит при последующей обработке тетраоксидом осмия в окислительно-восстановительной реакции, катализируемой рутениевым красным, при которой низшие окислы осмия осаждаются на окисленном субстрате. Поскольку рутениевый красный плохо проникает в ткани, его рекомендуется добавлять прямо в фиксирующую смесь.

Контрастирование рутениевым красным по Лафту

1. Кусочки ткани фиксируют в растворе глутарового альдегида и рутениевого красного 

(0,5 мл 3,6 % глутарового альдегида+0,5 мл 0,5 М какодилатного буфера рН 7,3 + 0,5 мл 0,15-0,3 % водного раствора рутениевого красного) в течение 1 ч при 4 °С.

2. Промывают в 0,15 М какодилатном буфере 3 раза по 3 мин.

3. Дополнительно фиксируют в течение 3 ч при 20 °С в следующем растворе: 

0,5 мл 5 % тетраоксида осмия + 0,5 мл 0,2 М какодилатного буфера рН 7,3+0,5 мл 0,15-0,3 % раствора рутениевого красного.

4. Быстро промывают в буферном растворе, обезвоживают в спиртах, заливают в эпоксидную смолу.

Результат: 

контрастируются полианионы с умеренной и высокой плотностью заряда, представленные в тканях главным образом внеклеточными кислыми ГАГ.

Для очистки рутениевого красного рекристаллизацией 1 г рутениевого красного помещают в 10 мл 0,5 н. раствора аммиака при 60 °С. Нерастворимый остаток отделяют от горячего раствора центрифугированием. Надосадочную жидкость остужают до 0 °С. Образующийся при этом осадок промывают водой, охлажденной до 0 °С, спиртом и диэтиловым эфиром, а затем высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Окраска кармином по Бесту

Классическая ШИК-реакция и различные ее модификации, направленные на выявление гликогена, не могут быть рекомендованы для всех случаев, особенно если ткань содержит вещества, имеющие ту же локализацию, что и гликоген, дающие положительную ШИК-реакцию: мукопротеиды, гликопротеиды и ненасыщенные липиды. В таких случаях лучшие результаты может дать карминовый метод Беста, хотя применение этого чисто эмпирического метода трудно «примирить» со строгими гистохимическими требованиями.

Действующим началом природного кармина является карминовая кислота. Ее способность окрашивать гликоген зависит от ряда не до конца понятых физических и стереохимических факторов. Для лучшей сохранности гликогена в первоначальных прописях рекомендовалась заливка в целлоидин, однако можно использовать и парафиновые срезы, если перед перенесением в раствор Беста покрыть их тонким слоем целлоидина. Целлоидирования срезов можно избежать, фиксируя ткань в жидкости Марчи в течение 12-20 ч при 4 °С, промывая затем при 4 °С в течение 10-12 мин в 30 % спирте, инкубируя также при 4 "С в красящем растворе кармина и после дифференцирования быстро обезвоживая в двух сменах абсолютного ацетона.

При использовании этого метода необходимо проводить контрольные реакции с перевариванием гликогена амилазой, диастазой или слюной.

1. Материал фиксируют по Лилли, Жандру, Россману, Кар­нуа, Шабадашу, Буэну или в 100% спирте; заливают в парафин; можно также использовать целлоидиновые или замороженные срезы.

2. Депарафинированные срезы доводят до абсолютного спирта.

3. Целлоидируют срезы в 1 % растворе целлоидина (в смеси равных частей спирта и эфира) в течение 2 мин.

4. Просушивают срезы на воздухе, уплотняют в 70 % спирте и помещают в дистиллированную воду.

5. Проводят интенсивное окрашивание ядер в гемалауне по Майеру или в гематоксилине по Эрлиху.

6. Промывают в дистиллированной воде, в случае необходимости дифференцируют в солянокислом спирте и снова промывают в воде.

7. Окрашивают в растворе кармина в течение 10-30 мин. 

Маточный раствор кармина: 2 г кармина, 1 г карбоната калия и 5 г хлорида калия растворяют в 60 мл дистиллированной воды и кипятят несколько минут на слабом огне. 

Раствор после охлаждения фильтруют и добавляют в него 20 мл раствора аммиака (плотность 0,880). Раствор готов к непосредственному применению, его можно хранить в темной колбе в течение нескольких недель, в холодильнике — до 3 мес. 

Красящий раствор кармина: 20 мл профильтрованного маточного раствора кармина + 30 мл раствора аммиака + 30 мл метанола (сохранность несколько дней).

8. Переносят срезы непосредственно в смесь для дифференцирования (40 мл метанола + 50 мл абсолютного этанола + 100 мл дистиллированной воды). 

Дифференцируют в двух порциях до тех пор, пока видимые глазом следы красителя перестанут выхо­дить из среза в раствор-от нескольких секунд до нескольких минут.

9. Промывают в 80 % спирте, обезвоживают в абсолютном спирте, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Результат:

гликоген окрашивается в интенсивный красный цвет, ядра — в темно-синий.

Контрольные реакции в гистохимии углеводов

Описанные методы выявления углеводов являются в основном лишь реакциями на химические группы. Для установления специфичности проведенной реакции и для дифференциальной локализации полисахаридов используют методы блокирования реакционноспособных групп и ферментативного гидролиза.

Кислые группы (карбоксильные, фосфатные и сульфатные) можно блокировать метилированием в растворах метанол-НС1, метанол-тионилхлорида и метанол-метилиодида. В результате этого ослабляются базофилия и метахромазии элементов ткани.

Метилирование по Белло—Гайеру

1. Депарафинированные срезы промывают в двух сменах абсолютного спирта, а затем в двух сменах абсолютного метанола.

2. Помещают срезы при 24С на 4-6 ч в следующий рас­твор: 1 мл тионилхлорида медленно добавляют в 50 мл абсолютного метанола (перед использованием раствор можно хранить в течение ночи). Контрольные срезы-без обработки тионилхлоридом.

3. Промывают в 70 % спирте и дистиллированной воде.

4. Проводят соответствующее окрашивание.

Результат: 

6-часовая обработка полностью устраняет базофилию ткани. 

Базофилия цитоплазмы, обусловленная СООН-группами и РНК, снимается через 30 мин, а базофилия, обусловленная присутствием сульфатированных ГАГ, — через 4 ч.

Для дифференциации кислых ГАГ и нейтральных гликопротеинов обычно используют переваривание гиалуронидазой инейраминидазой.

Гиалуронидаза В, выделенная из культур пневмококков, стрептококков, стафилококков и Clostridium welchii, расщепляет гиалуроновую кислоту, а гиалуронидаза А, полученная из семенников быка, гидролизует, помимо гиалуроновой кислоты, еще и хондроитинсульфаты А и С.

Удаление кислых гликозаминогликанов 

путем ферментативного гидролиза с гиалуронидазой

1. Материал фиксируют в одной из смесей, рекомендованных для фиксации полисахаридов, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды через ряд спиртов убывающей концентрации.

3. Обрабатывают срезы в течение 4 —6 ч при 37 °С следующим раствором: 0,3 — 0,6 мг/мл гиалуронидазы из семенников в 0,1 н. фосфатном или ацетатном буфере (рН 6,0). 

Контрольные срезы инкубируют в буфере в таких же условиях.

4. Окрашивают контрольные срезы и срезы, обработанные в растворе гиалуронидазы, 0,1 % раствором толуидинового синего в течение 1-2 ч.

5. Тщательно промывают в дистиллированной воде.

6. Заключают в глицерин-желатин или после обезвоживания и просветления в ксилоле в бальзам.

Результат: 

метахроматическое окрашивание в контрольных срезах и отсутствие его в срезах, обработанных гиалуронидазой, свидетельствуют о наличии гиалуроновой кислоты или хондроитинсульфатов А и С.

Нейраминидаза (сиалидаза, выделенная из культуральных сред Clostridium perfringens и Vibrio cholerae, а также из противогриппозной вакцины) селективно удаляет из гистологических

срезов сиаловую кислоту, уменьшая окраску ШИК-позитивных гликопротеинов, а также ослабляя метахромазию.

Следует учитывать, что буферный раствор, не содержащий нейраминидазы, может переводить в раствор значительную часть связанной нейраминовой кислоты в составе сиаломукоидов.

Ферментативное переваривание гликогена на гистологических срезах проводят с помощью диастазы, амилазы или слюны. 

Обычно используют диастазу солода по Лилли, которая катализирует гидролиз гликогена, главным образом до дисахарида мальтозы.

Ферментативный гидролиз диастазой 

для удаления гликогена по Лилли

1. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды.

2. Обрабатывают в 0,1-1 % растворе диастазы солода на изотоническом растворе хлорида натрия при комнатной температуре в течение 2 ч или при 37 "С 30-40 мин.

3. Промывают в дистиллированной воде и проводят окрашивание на гликоген 

(ШИК-реакция или окрашивание кармином по Бесту).

Результат: 

вещества, которые в прямом опыте окрашиваются при ШИК-реакции или кармином по Бесту, но исчезают из среза после обработки диастазой, следует считать гликогеном.

Примечание. 

Различия между молекулами гликогена с разветвленными и неразветвленными цепями могут быть выявлены в срезах путем их обработки 0,5 % (b-амилазой в 0,004 М ацетатном буфере (рН 5,0) вместо 

a-амилазы. (b-Амилаза расщепляет только молекулы с разветвленными цепями.