Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ

Методические указания по изучению общетоксического

действия фармакологических веществ

СОСТАВИТЕЛИ:

д. м. н., проф. Е. В. Арзамасцев;

член-корр. РАМН, проф. Т. А. Гуськова;

д. м. н., проф. И. В. Березовская;

д. м. н., проф. Б. И. Любимов;

д. б. н., проф. С. С. Ли- берман;

к. м. н. О. Л. Верстакова

Введение

Целью доклинических токсикологических исследований фармакологического вещества является установление характера и выраженности его повреждающего действия на организм экспериментальных животных и оценка его безопасности.

Общепринятым является разделение токсикологических исследований на изучение общетоксического действия и исследование специфических видов токсичности (аллергенность, иммунотоксичность, репродуктивная токсичность, мутагенность, канцерогенность).

Изучение общетоксического действия позволяет решить следующие задачи:

1. Определить переносимые и токсические дозы фармакологического вещества.

2. Выявить наиболее чувствительные к изучаемому фармакологическому веществу органы и системы организма, характер и степень патологических изменении в них, а также исследовать обратимость вызываемых повреждений.

3. Изучить зависимость токсических эффектов от дозы и длительности применения фармакологического вещества.

Соответственно этим задачам исследование общетоксического действия подразделяется на два этапа:

1. Изучение "острой" токсичности фармакологического средства при однократном или дробном введении через короткие (не более 3—6 ч) интервалы в течение суток.

2. Изучение "хронической" токсичности при повторном длительном введении (продолжительность введения определяется предполагаемым курсом клинического применения).

1. Общие положения

1.1. Условия проведения эксперимента

Токсикологические исследования обязательны как для субстанции, так и для всех лекарственных форм фармакологического вещества. При проведении исследования субстанции в полном объеме изучения лекарственной формы вещества может быть сокращено. Если лекарственная форма содержит вспомогательные вещества (стабилизаторы, растворители и т. п.), не разрешенные для применения в медицинской практике, то каждое из этих веществ исследуют отдельно. При комбинации нескольких фармакологических веществ в одной лекарственной форме (фиксированная комбинация) изучают токсичность комбинации в целом и каждого ингредиента в отдельности, если он не был ранее разрешен для применения в медицинской практике.

При изменении соотношения ингредиентов в комбинированной лекарственной форме или увеличении дозировки, для решения вопроса о необходимости проведения токсикологических исследований следует провести переоценку новой комбинации с точки зрения безопасности ее применения.

Необходимо проведение токсикологических исследований воспроизведенных препаратов (генериков) в следующих случаях:

а) препараты, не имеющие разрешения к медицинскому применению в стране-производителе и отличающиеся по составу лекарственной формы от аналогичных, зарегистрированных в России;

б) препараты, не отличающиеся по составу лекарственной формы, но содержащие ингредиенты нефармакопейного качества, или с изменением состава оболочки;

в) препараты, полученные на основе биотехнологии (в любых случаях).

2. Минимальный объем токсикологических исследований генериков

должен включать:

а) сравнительное изучение острой токсичности на грызунах при том способе введения, который указан в инструкции по применению препарата;

б) сравнительное изучение субхронической токсичности на животных (крысы, кролики, собаки или др.) при введении препарата не менее 2 нед, при способе применения, указанном в инструкции, в дозах, вызывающих токсический эффект, с обязательным гистологическим исследованием внутренних органов и области введения препарата.

1.2. Фармакологическое вещество

1.2.1. Характеристика

Для проведения токсикологического изучения необходимо иметь характеристику субстанции (предварительную нормативную документацию; проект ФС) фармакологического вещества, согласно которой оно идентифицируется, устанавливаются пределы содержания примесей, определяется его стабильность. Дается также характеристика (проект ФСП) лекарственной формы и вспомогательных веществ, использованных при ее получении (растворители, наполнители, стабилизаторы и др.). Если характеристика фармакологического вещества меняется, например в результате модификации способа получения субстанции или лекарственной формы, следует оценить влияние этого изменения в связи с данными, полученными при токсикологическом изучении исходного фармакологического вещества.

1.2.2. Физические свойства

Следует иметь данные о растворимости, гидрофобности или липофиль- ности фармакологического вещества, размере и форме кристаллов. Если по условиям эксперимента субстанцию исследуют в виде раствора или взвеси с использованием ингредиентов, не указанных в соответствующих лекарственных формах фармакологического вещества, необходимо привести характеристику этих ингредиентов и данные о стабильности используемого раствора. При исследовании хронической токсичности применение дополнительных растворителей не рекомендуется.

1.2.3. Данные о терапевтической активности

Для проведения токсикологических исследований должны быть представлены данные, характеризующие терапевтическую активность фармакологического вещества в эксперименте на животных, с указанием вида животных, использованных моделей, доз и путей введения. Следует также указать предполагаемые направления клинического изучения фармакологического вещества, рекомендуемые дозы, способы и длительность применения.

1.3. Экспериментальные животные

Для токсикологических исследований применяют здоровых половозрелых животных, прошедших карантин не менее 10—14 дней. Необходимо указать питомник, из которого получены животные. Неконтролируемыми питомниками пользоваться не следует.

У животных разных видов токсичность фармакологических веществ может сильно отличаться, поэтому необходимо проводить исследования на нескольких видах животных, причем наряду с грызунами обязательно использовать не грызунов. Из грызунов наиболее удобны для токсикологических экспериментов мыши и крысы. Можно применять также кроликов, морских свинок, собак, а также мини-свиней и обезьян.

Токсикологические исследования можно проводить как на нелинейных, так и на линейных животных. В последнем случае следует указать линию (штамм, линия) животных, поскольку чувствительность к фармакологическому веществу может меняться и внутри вида в зависимости от линии.

Эксперименты проводят на животных обоего пола, учитывая полученные данные отдельно для самок и самцов.

Следует указать возраст животных, так как в зависимости от возраста может измениться фармакокинетика и, в связи с этим, — токсичность фармакологического вещества. Для того чтобы избежать большого разброса в исследуемых показателях, рекомендуется использовать животных одного возраста. Динамика массы тела животных зависит от многих факторов, в том числе и от исходной величины, поэтому разброс по исходной массе не должен превышать ± 10 %.

Содержание экспериментальных животных должно соответствовать действующим Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев).

Следует учитывать, что чувствительность животных к фармакологическому веществу может изменяться под влиянием ряда внешних факторов (температура, влажность, освещенность и кратность воздухообмена помещения, состав подстилок, загрязненность помещения ксенобиотиками и др.).

Существенное действие на чувствительность животных к фармакологическому веществу может оказать состав пищи. Рекомендуется давать животным стандартную диету в соответствии с действующими нормами.

Для питья мелких лабораторных животных целесообразно использовать автопоилки. Кормление следует производить в фиксированное время, так как прием пищи может изменить чувствительность животных к фармакологическому веществу.

Наряду с подопытными животными, получающими исследуемые фармакологические вещества, в аналогичных условиях должны содержаться контрольные животные.

1.3.2. Физиологическое и патологическое состояние животных

Действие фармакологического вещества может изменяться под влиянием ряда физиологических факторов. Кроме факторов, упомянутых выше, при проведении токсикологических исследований необходимо учитывать суточные и сезонные ритмы деятельности организма. В связи с этим рекомендуется вводить фармакологические вещества в фиксированное время суток и указывать время года, когда проводились эксперименты.

Фармакологические вещества, предназначенные для детей, следует дополнительно изучать на новорожденных и неполовозрелых растущих животных (по специальным методическим рекомендациям), а вещества для геронтологической практики дополнительно изучают на старых животных. Учитывая изменение реактивности организма при беременности, фармакологические вещества, специально рекомендованные для беременных женщин, исследуют на животных в разные периоды беременности.

Обязательным является проведение токсикологических исследований на здоровых животных, хотя наличие патологии может изменить чувствительность животных и позволяет в ряде случаев получить дополнительную информацию о токсичности фармакологического вещества. Однако широкое использование животных с искусственными, спонтанными или генетическими заболеваниями в настоящее время не может быть рекомендовано при токсикологических исследованиях, поскольку ценность данных, полученных в таких условиях эксперимента, требует дальнейшего изучения и подтверждения.

1.3.3. Количество животных, используемых в опыте

Число животных в каждой группе должно быть достаточным для того, чтобы оценить характер и частоту проявления токсических эффектов и позволить подвергнуть результаты опытов статистической обработке. Вместе

с тем статистический анализ не должен маскировать случайные биологические наблюдения, даже если они статистически недостоверны.

При комплектовании групп экспериментальных животных для хронического токсикологического эксперимента надо иметь в виду необходимость исследования динамики возможного токсического эффекта исследуемого фармакологического вещества, для чего следует производить поэтапный забой животных в процессе введения препарата и в различные сроки после окончания его введения с целью выявления обратимости наблюдаемой патологии.

2. Изучение "острой" токсичности

2.1. Общие положения

Острая токсичность — вредное действие препарата, проявляющееся после его однократного применения или повторного введения через короткие (не более 6 ч) интервалы в течение суток.

Целью изучения острой токсичности является определение переносимых, токсических и летальных доз фармакологического вещества и причин наступления гибели животных.

Основные параметры острой токсичности лекарственного средства могут быть вычислены с помощью любых статистических методов, однако предпочтительнее пользоваться методами, позволяющими провести сравнительную оценку исследованных параметров для двух или более фармакологических веществ, например методом Литчфилда и Уилкоксона. Использованный метод должен быть обязательно указан в отчете.

2.2. Вид и количество подопытных животных

Острую токсичность следует изучать на нескольких видах животных, причем обязательно использовать тот вид, на котором был показан терапевтический эффект фармакологического вещества и на котором будет исследована токсичность при длительном введении. Обычно используют 2—3 вида грызунов и не грызунов (мыши, крысы, морские свинки, кролики или др.). Группы самцов и самок подопытных животных формируют отдельно. Для мелких грызунов каждая группа должна содержать не менее 5—6 самок и такое же количество самцов.

Количество собак и кроликов в группе может быть 3—5. Общее количество мелких грызунов, использованных в опыте, должно обеспечить возможность вычисления ЛД50. Если из-за низкой токсичности фармакологического вещества нельзя определить ЛД50, следует указать максимальную дозу, которая была введена животным.

2.3. Пути введения

У мелких лабораторных животных токсичность фармакологического вещества обычно исследуют при нескольких путях введения, причем обязательно использовать тот путь, при котором была показана терапевтическая активность фармакологического вещества, и путь, который предполагается для клинического изучения. Фармакологические вещества, предназначенные для системного введения, вводят внутрь и парентерально (внутрибрюшинно, если они не растворимы в воде, внутривенно и подкожно, если они растворимы). Следует учитывать, что при определении токсичности имеют значение концентрация и объем вводимого фармакологического вещества, а при внутривенных инъекциях также скорость введения. Фармакологические вещества, предлагаемые для местного применения, наносят или вводят в соответствующую область согласно способу, предлагаемому для клиники. Кроме того, дополнительно изучают их токсичность при системном применении.

Фармакологические вещества, предлагаемые для приема внутрь, следует вводить через зонд, закладывать на корень языка, исключение могут составить полимеры, которые можно давать с пищей.

Фармакологические вещества, рекомендованные для ингаляции, изучают, помещая мелких лабораторных животных в затравочные каморы, снабженные специальными затравочными устройствами.

Сравнение параметров токсичности при разных путях введения может дать ориентировочные данные о скорости и степени всасывания фармакологического вещества, а сопоставление прямых, отражающих зависимость величины токсического эффекта от дозы, позволяет судить о сходстве или различии в механизмах, вызывающих летальный исход при разных путях введения.

2.4. Продолжительность наблюдения и регистрация картины интоксикации

Общая продолжительность наблюдения за животными при исследовании острой токсичности должна составлять не менее 2 нед, причем в первый день после введения животные должны находиться под непрерывным наблюдением.

Регулярно фиксируют общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координации движений, тонус скелетных мышц, реакцию на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние волосяного и кожного покрова, окраску слизистых оболочек, размер зрачка, положение хвоста, количество и консистенцию фекальных масс, частоту мочеиспускания и окраску мочи, потребление корма и воды, изменение массы тела и другие показатели, которые могут быть использованы для выявления токсического эффекта. Для отдельных фармакологических веществ целесообразно исследовать некоторые гематологические показатели (морфологические, биохимические, свертываемость крови).

Весьма существенной является регистрация сроков развития интоксикации и гибели животных. Целесообразно проводить макроскопическое исследование внутренних органов погибших животных, а в случае отсроченной гибели животных — и микроскопическое исследование (степень кровенаполнения органов, наличие кровоизлияний, изъязвлений слизистых оболочек и др.).

Результаты следует представлять в таблице (табл. 1).

Таблица 1

Вид животных

Пол

Дозы

мг/кг

Число погибших животных

ЛД 10

ЛД16

ЛД50

(с доверительными границами)

ЛД84

3. Исследование кумуляции

При выборе доз для исследования хронической токсичности фармакологического вещества следует учитывать его кумулятивное действие. Поэтому до проведения хронических токсикологических экспериментов рекомендуется определить индекс кумуляции фармакологического вещества, т. е. отношение ЛД50 при однократном введении к ЛД50 при кратном введении. Для этой цели можно использовать различные методы, основанные на учете гибели животных при повторном введении фармакологического вещества.

Предпочтение следует отдать изучению кумуляции методом Lim’a и со- авт., позволяющим оценить не только кумулятивные свойства, но и привыкание.

Схема изучения кумуляции методом субхронической токсичности по Lim’y и соавт. следующая (табл. 2):

Таблица 2

Дни введения	Число животных (п = 10)	Доля от ЛД50
1-4		0,1
5-8		0,15
9-12		0,22
13-16		0,34
17-20		0,50
21-24		0,75
25-28		1,12

Суммарная доза за 24 дня = 12,8 ЛД50, максимальная продолжительность эксперимента 24 ± 4 дня.

где Кк — коэффициент кумуляции, ЛД50n — средняя смертельная доза при n-кратном

введении, ЛД50, — средняя смертельная доза при однократном введении.

Кк < 1 — кумуляция.

Kk > 1 — привыкание.

4. Изучение "хронической"токсичности

4.1. Общие положения

Целью хронических токсикологических экспериментов является характеристика степени повреждающего действия фармакологического вещества при его длительном введении, выявление наиболее чувствительных органов и систем организма, а также исследование степени обратимости вызываемых им повреждений.

Продолжительность введения фармакологического вещества при изучении хронической токсичности зависит от предполагаемой длительности при применении в клинике (см. табл. 3).

Таблица 3. Продолжительность введения фармакологического вещества экспериментальным животным в зависимости от длительности его применения у человека

Длительность применения препарата у человека	Длительность введения фармакологического вещества животным
Однократное введение	5—7 дней
2—6 дней	14 дней
7—14 дней	1 мес
15—30 дней	2—4 мес
1—6 мес	6—12 мес

4.2. Вид и количество экспериментальных животных

Хроническую токсичность изучают не менее чем на двух видах животных. Желательно использовать животных, на которых был получен терапевтический эффект. Обычно хронические эксперименты проводят на крысах, кроликах, морских свинках и собаках.

Если воспроизведенное фармакологическое вещество исследуют параллельно с его оригинальным фирменным аналогом (стандартное лекарственное вещество), изучение хронической токсичности можно ограничить экспериментами на грызунах (крысах, кроликах и др.). Группы подопытных животных формируют отдельно из самок и самцов. Группы мелких лабораторных животных должны содержать не менее 10 особей, крупных животных — не менее 4.

4.3. Пути введения фармакологического вещества

Основным способом введения фармакологического вещества является способ, рекомендованный для клинического изучения. Фармакологическое вещество, предназначенное для применения внутрь, вводят лабораторным животным через зонд в желудок или закладывают на корень языка, так как это обеспечивает более точное дозирование, чем добавление фармакологического вещества в корм. Количество фармакологического вещества, получаемого животным за один прием, рассчитывают на единицу массы тела животного в пересчете на действующее вещество (можно вести расчет на единицу поверхности тела). Фармакологическое вещество вводят в виде субстанции и той лекарственной формы, которая будет передана в клинику.

4.4. Исследуемые дозы

Хроническую токсичность фармакологического вещества при его системном применении исследуют в двух-трех (как правило, в трех) дозах. При выборе доз руководствуются результатами, полученными при исследовании острой токсичности фармакологического вещества, его способностью вызывать кумулятивный эффект, а также максимальными суточными дозами, в которых фармакологическое вещество рекомендовано для клинического изучения.

Введение высшей дозы предполагает выявление возможных токсических эффектов и гибель части животных. Эта доза может быть рассчитана

с учетом ЛД50, полученной при изучении острой токсичности исследуемого вещества для данного вида лабораторных животных. Минимальная доза должна быть близка к терапевтической дозе, рекомендуемой для клинического изучения. Третья доза является промежуточной. При постановке экспериментов обязательно наличие контрольной группы животных, содержащихся в таких же условиях, как и подопытные, и получающих вспомогательные ингредиенты, входящие в состав исследуемой лекарственной формы фармакологического средства, тем же способом, при котором изучают токсичность самого вещества.

Фармакологические вещества, предназначенные для ежедневного применения у человека, вводят экспериментальным животным 7 дней в неделю.

Информация о межвидовом переносе доз представлена в таблицах 4 и 5.

Пример межвидового пересчета:

ЕД50для крыс массой 200 г — 10 мг/кг.

Для собаки с массой тела 9 кг доза рассчитывается по формуле:

Таблица 4. Коэффициенты пересчета доз (мг/кг, мг/м2) для мыши, крысы, обезьяны, собаки и человека [Freireich at al., 1966)]

Вид животного	Масса тела (кг)	Площадь поверхности тела (м2)	Коэффициент пересчета
Мышь	0,018	0,0062	2,9
	0,020	0,0066	3,0
	0,022	0,0071	3,1
	0,024	0,0075	3,2
Крыса	0,050	0,0122	4,1
	0,070	0,0153	4,6
	0,080	0,0167	4,8
	0,100	0,0194	5,2
	0,150	0,0254	5,9
	0,200	0,0308	6,5
	0,250	0,0357	7,0
Обезьяна	2,0	0,188	10,6
	2,5	0,217	11,5
	3,0	0,244	12,3
Собака	6,0	0,344	18,0
	7,0	0,369	19,0
	8,0	0,404	19,8
	9,0	0,437	20,6
Человек	5,0	0,26	19,0
	10,0	0,44	23,0
	20,0	0,80	25,0
	40,0	1,30	31,0
	60,0	1,62	37,0
	70,0	1,80	39,0
	80,0	1,96	41,0

Таблица 5. Коэффициенты для пересчета дозы в мг/кг на мг/м2 для разных видов животных в зависимости от массы тела [Уланова И. П. и др., 1968]

Вид животного	Масса тела (кг)	Коэффициент пересчета
Мышь	0,018	2,9
	0,020	3,0
	0,022	зд
	0,024	3,2
Крыса	0,050	4,1
	0,070	4,6
	0,080	4,8
	0,100	5,2
	0,150	5,9
	0,200	6,5
	0,250	7,0
Морская свинка	0,15	4,0
	0,20	4,8
	0,25	5,6
	0,30	6,4
	0,35	7,2
Кролик	1,5	10,9
	2,0	12,8
	2,5	14,7
	3,0	16,6
	3,5	18,5
Собака	10,0	21,6
	11,0	22,2
	12,0	23,6
	13,0	23,9
	14,0	24,2
	15,0	24,8

4.5. Наблюдение за животными и регистрация картины интоксикации

На протяжении всего опыта животные должны находиться под ежедневным наблюдением; отмечают потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек, поведение. Один раз в неделю животных взвешивают, регулярно (в опыте продолжительностью до 1 мес — не менее 2 раз, при более длительном исследовании — не менее 3 раз) исследуют функциональное состояние сердечно-сосудистой, нервной, эндокринной, выделительной и пищеварительной систем, изучают морфологические и биохимические показатели крови. Методы исследования для оценки функционального состояния органов и систем организма выбирает исследователь: они должны быть современными и достаточно чувствительными, чтобы обеспечить регистрацию признаков возможного повреждающего действия изучаемого фармакологического вещества.

Примерная программа оценки токсичности фармакологического вещества представлена в приложении 1.

Все животные, погибшие в течение опыта, подвергаются вскрытию для

установления характера повреждающего действия фармакологического вещества. После окончания введения фармакологического вещества проводят максимально полное обследование экспериментальных животных с помощью гематологических, биохимических и физиологических тестов. Часть животных из каждой группы забивают для патоморфологических исследований. Определяют массу органов и проводят их гистологическое исследование. За животными, оставленными в живых, проводят наблюдение в течение 1 мес, после чего их обследуют в том же объеме, что и животных, забитых сразу после окончания введения фармакологического вещества. Для исследования динамики развития возможной интоксикации периодически определяют изучаемые параметры. Опыты на мелких лабораторных животных проводят с таким расчетом, чтобы полученные результаты можно было подвергнуть статистической обработке.

При оценке изменений, наблюдаемых у животных в хроническом токсикологическом эксперименте, необходимо исключить возможность влияния всех побочных факторов, не связанных с приемом препарата (заболевание животных, их питание, содержание и т. п.).

Могут возникнуть спонтанные изменения гемограмм, биохимических показателей и анатомических характеристик, которые следует учитывать при объяснении результатов. Не следует пренебрегать необъясненными данными, их надлежит подвергнуть дальнейшему изучению.

В ряде случаев в дополнение к указанным выше методам может потребоваться применение электронной микроскопии, гистохимических, авторадиографических и других методов исследования.

Патологические изменения, возникающие у животных после введения высоких доз фармакологического вещества, дают ценную информацию для характеристики его токсических свойств, однако эта информация должна быть подвергнута тщательному анализу и полученные результаты следует рассматривать в качестве предупреждения, а не противопоказания для клинических испытаний.

При решении вопроса о возможности передачи препарата на клиническое изучение исследователь должен учесть следующие факторы:

1. Терапевтическую широту фармакологического вещества, т. е. соотношение минимальной токсической и терапевтической доз.

2. Характер и обратимость выявленной патологии.

Заключение должно содержать суждения исследователей о степени опасного острого и хронического отравления на основании проведенных исследований, прогноз возможных побочных реакций и необходимых ограничений, при клинических испытаниях.

Результаты доклинических токсикологических исследований фармакологического вещества являются частью материалов, оцениваемых в аспекте пользы и риска при разрешении клинических испытаний.

Схема отчета об исследовании общетоксического действия

фармакологического вещества

Отчет должен содержать следующие разделы: титульный лист, список исполнителей, оглавление, реферат, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты проведенных исследований, заключение, список литературы, приложение.

Титульный лист: содержит название организации-исполнителя, утверждение отчета, заверенное подписью руководителя учреждения и печатью организации, название отчета, должность, фамилию, имя, отчество и подпись руководителя проведенных исследований.

Список исполнителей: ответственный исполнитель, исполнители — фамилия, имя, отчество, должность, степень, звание, подпись.

Оглавление: перечень разделов с указанием страниц отчета.

Введение: цель и задачи исследования.

Обзор литературы: информация об оригинальном фармакологическом веществе или литературные сведения о воспроизведенном препарате.

Материалы и методы: физико-химическая характеристика субстанции и лекарственной формы, их соответствие проекту нормативной документации (ФСП, ФС) или качественный состав лекарственной формы воспроизведенного лекарственного препарата, серия, соответствие проекту ФСП.

Характеристика использованных лабораторных животных (источник получения, масса или возраст, пол, условия содержания).

Схема эксперимента, обоснование выбранных доз.

Описание методов исследования и метода статистической обработки данных.

Результаты проведенных исследований: описание острой токсичности, кумуляции и хронической токсичности в соответствии с полученными достоверными изменениями изученных показателей и результатами патоморфологических исследований, способ умерщвления животных.

Заключение: краткое обсуждение полученных результатов, прогноз возможных побочных эффектов, рекомендуемые ограничения или необходимый контроль при проведении клинических испытаний.

Список литературы.

Приложение: таблицы индивидуальных показателей и результаты их статистической обработки по всем изученным тестам, краткое индивидуальное описание гистологических изменений органов и тканей лабораторных животных.


Приложение 1. Перечень	рекомендуемых тестов
Рекомендуемые исследования	Рекомендуемые тесты
Интегральные показатели	Внешний вид, поведение, симптомы интоксикации, прирост массы тела (еженедельно), суточное потребление пищи и воды (еженедельно).
Гематологические исследования Биохимические исследования Физиологические исследования Нагрузочные пробы	Содержание в периферической крови эритроцитов, рети- кулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарная формула, количество гемоглобина, гематокрит, параметры коагулограммы, резистентность эритроцитов. Общий белок, белковые фракции, общий холестерин, общие липиды, триглицериды сыворотки крови, глюкоза крови, активность ЩФ, АЛТ, ACT, ЛДГ и др. ЭКГ в II отведении, параметры ЭКГ (амплитуда зубцов Р, R, S, Т, длительность (в с) интервалов P—Q, QRS, Q— Т, R—R, комплекса), частота сердечных сокращений. Поведенческие реакции методом "открытого поля". Сум- мационно-пороговый показатель. Диурез (спонтанный или с водной нагрузкой), pH, удельная масса мочи Гексеналовый сон. Бромсульфалеиновая проба. Нагрузка феноловым красным

Рекомендуемые исследования

Рекомендуемые тесты

Патоморфологические исследования

Вскрытие, макроскопическое описание органов и тканей, места введения, определение относительной массы органов, гистологическое исследование (головной мозг, сердце, печень, легкие, селезенка, тимус, щитовидная железа, лимфатические узлы, желудок, кишечник, надпочечники, почки, мочевой пузырь, семенники, яичники, костный мозг, место введения)

Примечание. Перечень тестов при изучении воспроизведенных препаратов может быть сокращен с акцентом на известные побочные эффекты препарата.

Приложение 2. Максимально допустимые количества жидкости (в мл) для некоторых видов лабораторных животных в зависимости от пути введения

	Масса те- ла (г)	Путь введения
Вид животных	Масса те- ла (г)	в желудок	под кожу	в мышцу	в вену	в брюшную полость
Мышь	20-24 25-30 >30	0,5 0,8 3,0	1,0	0,5	0,2-0,5	1,0
Крыса	100-190 200-240 250-300 >300	3.0 4,0-5,0 6.0 8,0	5,10	5,0	2,0	5,0
Морская свинка	250-300	4,0-5,0	15,0	5,0	5,0-8,0	5,0
Кролик	2000-1400 2500-3000 >3000	100,0 150.0 200.0	30,0	15,0	20,0	20,0-30,0

Приложение 3. Соотношение между массой и площадью поверхности тела человека и

экспериментальных животных

Человек. Вид животных	Масса тела (г)	Поверхность тела (см2)	Отношение поверхности тела к массе (см2/кг)
Человек	70 000	18 000	257
Кролик	1500	1240	826
Морская свинка	400	480	1200
Крыса	200	304	1517
Мышь	20	61	3050

Приложение 4. Возраст и масса взрослых животных, используемых для определения острой токсичности

Вид животных	Возраст (мес)	Масса тела (г)
Белые мыши	2,0-2,5	18-22
Белые крысы	2,5-4,0	150-240
Морская свинка	3-4	450-500
Кролики	4	2000-3000
Собаки	9	Зависит от породы

Рекомендуемые исследования

Рекомендуемые тесты

Патоморфологические исследования

	Масса те- ла (г)	Путь введения
Вид животных	Масса те- ла (г)	в желудок	под кожу	в мышцу	в вену	в брюшную полость
Мышь	20-24 25-30 >30	0,5 0,8 3,0	1,0	0,5	0,2-0,5	1,0
Крыса	100-190 200-240 250-300 >300	3.0 4,0-5,0 6.0 8,0	5,10	5,0	2,0	5,0
Морская свинка	250-300	4,0-5,0	15,0	5,0	5,0-8,0	5,0
Кролик	2000-1400 2500-3000 >3000	100,0 150.0 200.0	30,0	15,0	20,0	20,0-30,0

Приложение 3. Соотношение между массой и площадью поверхности тела человека и

экспериментальных животных

Человек. Вид животных	Масса тела (г)	Поверхность тела (см2)	Отношение поверхности тела к массе (см2/кг)
Человек	70 000	18 000	257
Кролик	1500	1240	826
Морская свинка	400	480	1200
Крыса	200	304	1517
Мышь	20	61	3050

Приложение 4. Возраст и масса взрослых животных, используемых для определения острой токсичности

Вид животных	Возраст (мес)	Масса тела (г)
Белые мыши	2,0-2,5	18-22
Белые крысы	2,5-4,0	150-240
Морская свинка	3-4	450-500
Кролики	4	2000-3000
Собаки	9	Зависит от породы

1. Беленький М. Л. — В кн.: Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. — Л., 1968. — 151 с.

2. Березовская И. В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения // Хим.-фарм. журн. — 2003. — Т. 37, № 3,- С. 32-34.

3. Березовская И. В., Иванова В. М. Актуальные проблемы безопасности дженериков // Бюллетень ВНЦ БАВ. — Старая Купавна, 2002. — С. 37—52.

4. Березовская И. В., Митрохин Н. М. Экспресс-методы определения острой токсичности // Бюллетень ВНЦ БАВ. — М., 1990. — С. 45—67.

5. Балынина Е. С., Березовская И. В. Сравнительная оценка методов определения ориентировочной реакции крыс в токсикологическом эксперименте // Фарм. и токси- кол. - 1976. - № 5. - С. 635-638.

6. Голиков С. Н., Саноцкий И. В., Тиунов Л. А. Общие механизмы токсикологического действия. — Л.: Медицина, 1986. — С. 279.

7. Липперт Г. Международная система единиц в медицине. — М.: Медицина, 1980. — С. 208.

8. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. проф. В. В. Меньшикова. — М.: Медицина, 1987.

9. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия) / Под ред. проф. И. В. Саноцкого. — М.: Медицина, 1970. — С. 343.

10. Общая токсикология / Под ред. Б. А. Курляндского и В. А. Филова. — М.: Медицина, 2002. — С. 606.

11. Проблема нормы в токсикологии / Под ред. проф. И. М. Трахтенберга. — М.: Медицина, 1991. — С. 204.

12. Уланова И. П., Сидоров К. К., Халепо А. И. К вопросу об учете поверхности тела экспериментальных животных при токсикологическом исследовании / Под ред. А. А. Летавета и И. В. Саноцкого. — Л.: Медицина, 1968. — Вып. 10. — С. 18—25.

13. Freireich Е. J., Gehan Е. A., Rail D.E. et al. Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, hamster, dog, monkey and man // Cancer Chemother. Res. — 1966. - Vol. 50 - N 4. - P. 219-244.