МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АРХИТЕКТОНИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ КОРЫ 

БОЛЬШОГО МОЗГА

Е. П. Кононова

Прежде чем поступить под микроскоп для изучения, мозг подвергается длительной обработке.

Обработка мозга производится различно, в зависимости от материала (мозг взрослого или зародыша), а также от той цели, которую преследуют при его изучении (исследование клеточного строения, миэлиновых волокон, нервных окончаний и связей).

Мозг, извлеченный из черепа, подвергают фиксации, заливке и окраске. Одни методы окраски требуют заливки в парафин, другие-в целлоидин, а для некоторых специальных методов окраски кусочки мозга режут на замораживающем микротоме.

Мы остановимся главным образом на методе обработки головного мозга для целей архитектонического исследования коры, применяемом в Институте мозга. Этот метод заключается в сериальной обработке мозга, нарезанного во фронтальном направлении, что позволяет без потерь последовательно изучить строение коры большого мозга, границы между отдельными полями, а также проследить внутреннее строение борозд, их соотношения с полями, покрывающими стенки и дно борозд. Технически этот метод проще метода Экономо. 

Метод Экономо заключается в том, что мозг разрезают на отдельные кусочки, на фотографии отмечают соотношение между кусочками, затем каждый кусочек обрабатывают отдельно, а после обработки соотношения между кусочками восстанавливают и мозг подвергают изучению.

Обработка мозга человека и животных

Мозг должен быть извлечен из черепа в возможно более короткий срок после смерти. В трупе его нельзя оставлять более 24 часов, а летом и зимой срок должен быть еще меньше, чтобы не допустить разложения в первом случае и промерзания - во втором. При разложении и замерзании мозг плохо воспринимает окраску, что может вызвать большие затруднения при его изучении.

Извлекать мозг из черепа надо с большими предосторожностями, чтобы не повредить кору, которая покрывает его поверхность. Вынув мозг, его надо взвесить и тут же положить в банку с 10% формалином.

Чтобы не смять поверхности мозга, его обыкновенно подвешивают, в банке с формалином. 

Для этого под сосуды основания мозга подводят тонкую веревочку и в таком положении опускают мозг в банку, натягивая веревочку между противоположными краями банки, приподнимают мозг, вследствие чего он не касается стенок, веревочку укрепляют вокруг банки и оставляют мозг в подвешенном состоянии в течение 3х суток в формалине.

Через 3 дня мозг вынимают из формалина и осторожно, чтобы не поранить коры мозга, снимают с него оболочку, если с оболочкой тянется сосуд, его необходимо подрезать, иначе он может разрезать подлежащую часть коры.

Если оболочка удаляется плохо, мозг надо оставить в формалине; иногда на 4—5-й день оболочка снимается легче. После снятия оболочки мозг взвешивают и фотографируют. Затем ствол с мозжечком отрезают на границе ножки мозга и варолиева моста, мозг снова взвешивают и фотографируют с боковых, верхней, нижней поверхностей и с обоих полюсов. Далее мозг осторожно, чтобы не повредить коры внутренней поверхности, разрезают на полушария, с коры снимают оболочку, и внутренние поверхности также фотографируют.

Фотографии наклеивают на картон, отдельно каждую, затем их прорисовывает научный работник; при этом необходимо сличать фото­графию с самим мозгом, так как очень часто на фотографии получается обманчивое изображение борозд и их связи между собой: на фотографии борозда связана с отходящей от нее веточкой, на мозгу же между бороздами имеется переходная извилина, и они не являются непрерывными; это необходимо отмечать при прорисовке; иногда на фотографии видна бороздка, а на мозгу это только небольшое вдавление от мозговых сосудов; на мозгах со склерозированными сосудами эти вдавления могут достигать значительной глубины. Прорисовывать борозды лучше всего красной тушью, которая хорошо выделяется на фотографии на фоне темных полос борозд. Борозды, имеющие названия, помечаются двумя первыми буквами (sulcus centralis—се; fissura Sylvii—Sy; sulcus inter-parietalis-ip  и т.д.), а третичные бороздки, независимые или отходящие от больших борозд,—цифрами. Во время прорисовки надо следить, чтобы мозг не подсыхал, и смачивать его формалином.

После прорисовки каждое полушарие разрезают на макротоме на пять равных блоков. Толщина блоков зависит от величины мозга (для мозга взрослого человека она равна приблизительно 3,5 см).

На фотографии линиями отмечают места, где сделаны разрезы. Поверхности разреза каждого блока зарисовывают сначала на стекле, а затем рисунок со стекла при помощи проекционного аппарата переводят на бумагу; полученные проекции обводят тушью, на них отмечают названия (или цифровые обозначения) тех борозд, через которые прошел разрез.

Разрезанные блоки кладут в банку с 10% формалином, желательно каждое полушарие в отдельную банку, чтобы не спутать блоки. На банке делают надпись: фамилия или шифр, кому принадлежит мозг, какое полушарие и когда мозг положен в формалин уже после разрезов на макротоме Обычно мозг остается в формалине около 30—45 дней. Формалин меняют по мере его загрязнения (на поверхности плавают жировые блестки), а затем мозг обезвоживают и заливают в парафин или целлоидин.

Заливка в парафин

После фиксации в формалине мозг промывают в проточной воде и обезвоживают в спиртах, причем концентрация спирта постепенно повышается. Срок пребывания мозга в спиртах, хлороформе и парафине указан в табл. 1.

Таблица 1

Сроки пребывания мозга в спиртах, хлороформе и парафине (в днях)

Небольшие кусочки, вырезанные из мозга, в зависимости от их величины оставляют в каждом из реактивов на 1—1х/2 дня.

Препарат должен быть опущен в жидкость таким образом, чтобы она покрывала его поверхность полностью, чем больше жидкости, тем лучше фиксация. При смене спирта банки надо мыть или брать чистые. Употреблять 60°—70°—80° спирты 2 раза нельзя, тогда как спирт 96° II годен и для фиксации другого мозга, но как 96° I, а абсолютный спирт—как 96° II. Хлороформ можно использовать также 2 раза.

Если хлороформ не совсем чист, его необходимо профильтровать., В хлороформе мозг всплывает, поэтому весь блок покрывают сверху тонким слоем ваты.

Парафином можно пользоваться несколько раз, но предварительно его необходимо профильтровать. Начиная с парафина I (42—44° плавкости), блоки находятся в термостате, температура которого должна быть выше плавкости парафина. Далее заливают блоки в парафин 52—54е* плавкости. Для заливки приготовляют из плотной бумаги коробочку четырехугольной формы, размер ее несколько больше блока. В нее наливают немного парафина и кладут блок на ту поверхность, с которой надо начинать резать.

Блок 1—затылочный полюс, кладут на его переднюю поверхность; блоки 2—3—4—5—на их задние поверхности; нумерация препаратов; идет в каждом блоке отдельно.

На блок наливают расплавленный парафин плавкости 52—54° с таким расчетом, чтобы над блоком был довольно большой слой парафина, толщина всего блока не должна превышать 5—6 см.

Когда на поверхности жидкого парафина появится тонкая пленочка, т. е. парафин начнет застывать, коробочку с блоком опускают в воду, она может долгое время оставаться в воде, чтобы она не перевернулась, на ее свободную, уже застывшую, поверхность кладут небольшой груз.

На другой день блок освобождают от коробочки, обрезают кругом лишний парафин, придают ему четырехугольную форму (обрезать очень близко к мозгу не надо, а также не следует придавать блоку круглую форму, так как в таком виде он хуже режется). На боковых поверхностях блока надписывают шифр мозга, порядковый номер блока и полушарие (правое или левое). Блок крепко прикрепляют к подставке микротома стороной, противоположной той, с какой предполагают резать. К подставке микротома сначала прикрепляют толстый слой чистого парафина, на который затем накладывают блок, предварительно нагревают обе поверхности раскаленным ножом, затем их соединяют, крепко прижимая одну к другой, щель между ними заделывают парафином и опускают в воду. Через 20—30 минут блок готов к резке.

Имеет значение ориентировка блока на подставке: если подставка имеет четырехугольную форму, необходимо, чтобы внутренняя поверхность полушария (которую хорошо видно на блоке) соответствовала длинной стороне подставки. Подставку с блоком вставляют в микротом следующим образом: внутренняя сторона полушария должна быть перпендикулярна к бритве, и повернута в сторону режущего так, чтобы при резке правого полушария ближайшей к бритве оказалась нижняя поверхность мозга, а при резке левого—верхняя.

Резать нужно при комнатной температуре (не ниже 18—19°). При более низкой температуре блок приходится согревать дыханием или время от времени класть на него тряпочку, смоченную горячей водой. Если же температура в комнате высока, на блок кладут тряпочку, смоченную холодной водой, или даже лед. Летом в жаркую погоду от резки лучше воздержаться, так как парафин пристает к ножу и препарат может разорваться. Режут срезы толщиной 20 мкм. Берут не все срезы, а каждый 20-й и 21-й (20-й, 21-й, 40-й, 41-й, 60-й, 61-й и т. д.). Если предполагается несколько окрасок, то срезов берут больше.

После резки каждый срез переносят на заранее приготовленную бумагу с надписанными номерами и кладут под соответствующие номера в том положении, как их снимали с бритвы, не нарушая очередности. С бумаги срезы осторожно переносят в ванночку с водой (температура воды 34—35°), где они самостоятельно расправляются; из воды срезы вылавливают на заранее приготовленные стекла. Перед употреблением стекла моют в горячей воде, вытирают насухо и опускают на 24 часа в 96° спирт; перед резкой их вынимают из спирта, вытирают насухо, на короткой стороне стекла у самого края алмазным карандашом надписывают шифр мозга, порядковый номер блока, полушарие (правое или левое), а в углу «на прилегающей длинной стороне—порядковый номер, среза и его толщину (например:А 20 лев.4 1201.20мкм/ А20 пр. 2 860.20мкм) затем стекло смазывают специально приготовленным яичным белком (белок и глицерин в равных пропорциях сбивают и фильтруют в колбочку, куда кладут небольшой кристаллик фенола или тимола ); срезы вылавливают на стекла с обратной стороны сделанной надписи.

При этом срез мозга помещают на стекле так, чтобы его верхняя поверхность соответствовала тому краю стекла, где имеется надпись, а внутренняя была обращена в правом полушарии влево, а в левом—вправо. Затем стекло со срезом и небольшим количеством воды переносят на су­шильную печь при температуре 34—35°; срез слегка разглаживают и растягивают кисточкой, очень осторожно покрывают смоченной в воде пергаментной бумагой; слегка приглаживая тряпочкой по бумаге, из-под среза удаляют остальную воду. Готовые препараты кладут на сушильную печь на 25—30 минут, а затем убирают в специальный шкаф для препаратов. В таком виде неокрашенные препараты могут сохраняться годами.

Заливка в целлоидин

Некоторые методы окраски дают лучшие результаты, если мозг залит в целлоидин.

Белое вещество головного мозга хорошо окрашивается и на парафиновых препаратах, и на препаратах, залитых в целлоидин. Если надо выявить более тонкие миэлиновые волокна в коре головного мозга, то для этого требуется предварительная специальная фиксация в жидкости Мюллера и заливка в целлоидин. Фиксацию и заливку производят следующим образом. После короткого пребывания в формалине каждое полушарие режут на четыре блока и промывают их сутки в водопроводной воде. Затем блоки на 5 месяцев кладут в жидкость Мюллера (2,5 г двухромовокислого калия+1 г сернокислого натрия+100 см3 дистиллированной воды); первые 10 дней жидкость меняют ежедневно, затем в тече­ние месяца—через день, в следующем месяце—2 раза в неделю и, нако­нец,—раз в неделю.

Хранить мозг в жидкости Мюллера необходимо в темной посуде или в темном помещении.

После фиксации в жидкости Мюллера мозг промывают в водопроводной воде в течение 24 часов (можно промывать или под очень тонкой струйкой воды, или в ванночке, меняя воду несколько раз) и затем опускают в спирты.

Срок   пребывания   в   спиртах и целлоидине

1. Спирт 80°—4 недели (сменить 1 раз).

2. Спирт 96°—4 недели (сменить 1 раз).

3. Спирт абсолютный—4—6 недель (сменить 1 раз).

4. Спирт абсолютный+эфир в равных пропорциях—8 дней.

5. Жидкий целлоидин—6 недель (100 см3 абсолютного спирта + 100 см3 эфира+8 г сухого целлоидина).

6. Средний целлоидин—4 недели (10—12 г целлоидина с той же пропорцией жидкости).

7. Густой целлоидин—4 недели (15—18 г целлоидина с той же про­порцией жидкости).

Целлоидин приготовляют следующим образом. Берут соответствующее количество мелко нарезанного и хорошо высушенного целлоидина и в него наливают 100 см3 абсолютного спирта, прикрывают крышкой и оставляют на сутки. На другой день прибавляют 100 см3 эфира, помешивая стеклянной палочкой, и смесь оставляют еще на сутки, плотно закрывая крыш­кой. Раствор целлоидина I должен иметь консистенцию глицерина. Когда целлоидин готов, блоки кладут в низкие баночки на ту поверхность, с которой должна начаться резка, заливают целлоидином, крепко закрывают крышкой или крышку примазывают целлоидином и оставляют на указанные сроки. Когда мозг перекладывают в последний целлоидин, в котором он должен затвердевать, то на 4 недели крышку плотно закрывают, даже примазывают, а затем начинают понемногу приоткрывать, подкладывая под нее спички со всех сторон, чтобы застывание шло равномерно; за застыванием следует наблюдать.  Если в процессе застывания окажется, что кусок не полностью закрыт целлоидином, в баночку подливают еще целлоидин III.

Когда целлоидин становится достаточно твердым, его слегка подрезают, чтобы можно было достать блок из баночки, но все, же оставляют кругом блока небольшое количество целлоидина; затем поворачивают блок нижней поверхностью кверху, которая обыкновенно меньше застывает, и процесс застывания продолжается. Когда целлоидин становится твердым со всех сторон, готовый блок кладут в 80° спирт, где он остается до резки. Целлоидиновый блок нельзя оставлять без спирта, так как иначе он высохнет и будет непригоден для дальнейшей обработки.

Перед резкой блок подравнивают, чтобы верхняя и нижняя поверхности были параллельны, затем той поверхностью, которая была вверху, прикрепляют целлоидином III к подставке микротома. При этом и блок, и подставка должны быть абсолютно сухими. Если подставка деревянная, она требует специальной подготовки: чтобы обезжирить, ее кипя­тят в растворе соды, для обезвоживания обмывают спиртом и хорошенько* высушивают.

Резку производят на специальном микротоме, имеющем ванночку. В нее наливают 70° спирт, так как во время резки и блок, и нож должны находиться под спиртом. Срезы для изучения миэлиновых волокон в нервной ткани должны быть толщиной 40 а для клеток и других образований—20—25 [а. Срез в ванночке микротома или даже на ноже» расправляют, под него подводят заранее приготовленную бумажку надлежащей величины (несколько длиннее препарата), с отметкой номера среза, полушария и шифра мозга для сохранения последовательности препаратов.

При резке берут не все срезы, а каждый 20-й и 21-й (например 20-й и 21-й; 40-й и 41-й; 60-й и 61-й и т. д.), а из них для окраски— каждый 40-й.

Оставшиеся срезы на бумажках хранят в 70° спирту и используют по мере надобности.

Если предполагают проводить окраску препаратов несколькими способами или если мозг представляет большой интерес по своему строению или изменениям, берут большее количество препаратов (3 или 4 из каждого десятка).

Для сохранения целости срезов, как целлоидиновых, так и парафиновых, особенно при окраске миэлиновых волокон, их приходится иногда покрывать коллодием—коллодинировать. Для этого целлоидиновый срез на бумаге переносят в 80° спирт и с бумаги перекладывают на стекло (сохраняя бумагу с номером). Из 80° спирта перекладывают в 96° спирт, в абсолютный (в трех чашках), а затем на стекле заливают коллодием, дают коллодию застыть и опускают срез в проточную воду, где он отклеивается от стекла; затем его снова кладут на бумагу с номером и окрашивают, как целлоидиновые срезы.

Коллодинирование парафиновых препаратов употребляют только при окраске по Гейденгейну.

Парафиновые срезы освобождают от парафина в ксилоле, переносят в абсолютный спирт, который меняют 3 раза, а затем заливают коллодием; когда он застывает, опускают в холодную воду; со стекла препарат не сползает, а остается на нем, и его можно красить.

Коллодий приготовляют так: 4 г сухого целлоидина растворяют в 100 см3 абсолютного спирта и 100 см3 наркозного эфира; когда целлоидин растворится, его можно профильтровать, а затем коллодинировать. Коллодий готовится дня за 3—4 до употребления.

Обработка мозга эмбриона

Мозг эмбриона фиксируется несколько иначе, чем мозг взрослого человека, так как в мозгу эмбриона волокна еще не покрыты миэлином, ткань содержит больше влаги и обыкновенные фиксаторы (формалин, спирт) на мозг не действуют.

Обработка эмбрионального материала проводится следующим образом. Измеряют длину темя—копчик (если эмбрион доставлен целиком), окружность головки, а затем фиксируют в растворе сулемы (1000 см3 дистиллированной воды+ 50 г сулемы + 6 г поваренной соли). Раствор сулемы приготовляют заранее, перед употреблением к нему прибавляют ледяной уксусной кислоты (50 г на 1000 см3 раствора сулемы).

Эмбрионы до 3 месяцев фиксируют или целиком, или только головку. В более старших возрастах фиксируют извлеченный мозг. Погрузив головку эмбриона в фиксирующую жидкость, осторожно вскрывают черепную коробку и твердую мозговую оболочку и в таком виде оставляют на сутки; на другой день со всеми предосторожностями мозг вынимают из черепной коробки и кладут в раствор сулемы.

Эмбрион до 3 месяцев фиксируется 3 дня, 3—4 месяцев—5, 4—6 меся­цев—7, 6 месяцев и старше—10 дней (срок фиксации указан для извлеченного мозга).

После сулемы эмбрион или извлеченный мозг кладут в 20е спирт, в котором мозг фотографируют (наружные поверхности, верх и основание). После этого отрезают ствол с мозжечком, а полушария головного мозга обезвоживают в спиртах повышающейся концентрации (табл. 2). Мозг зародыша моложе 8 лунных месяцев опускают в спирт целиком, не разрезая, а старше 8 месяцев разрезают во фронтальном направлении на два блока, сразу через оба полушария.

Мозг плода старшего возраста, имеющего уже борозды, прорисовывают так же, как и мозг взрослого.

Чтобы освободить препараты от сулемы, в спирты (с 40° до 70 включительно) прибавляют 10% раствор йодистой настойки до получения цвета крепкого чая. Если во время фиксации спирт обесцвечивается, прибавляют еще йодистой настойки, помешивая осторожно палочкой.

При переводе мозга эмбриона из одной жидкости в другую необходимо соблюдать максимальную осторожность, не касаться мозга руками (лучше сливать жидкость, не вынимая мозг из банки). Из абсолютного спирта мозг эмбриона погружается в хлороформ I, хлороформ II, а затем в смесь хлороформа и парафина в равных частях (плавкости 44—46е) и, наконец, последовательно в парафины разной плавкости (I—44—46°; II—46—48°; III—48—52°). Парафин наливают в четыре чашечки, ставят в термостат (52—54°) и в указанные сроки переносят мозг эмбриона из одной чашечки в другую.

Заливают мозг эмбриона в парафин таким же образом, как и мозг взрослого.

Коробочка для заливки должна быть размером несколько больше мозга. В нее наливают парафин и погружают мозг так, чтобы его затылочный полюс был ближе к одной из стенок коробочки, так как с него начинают резать. Если мозг разрезан пополам во фронтальном направлении, каждый блок прикрепляют к подставке полюсами и резать начинают от середины к затылочному полюсу и к лобному.

Счет препаратов для каждого блока ведется отдельно. Мозг режется сериально. Из мозга эмбриона 3 месяцев берут все срезы и наклеивают по нескольку на одно стекло. У плода более старшего возраста срезы берут через один, а от 6 месяцев и старше — каждый 4-й срез.

Обычно срезы мозга эмбриона до 3 месяцев сохраняются все, а более старших возрастов — каждый 4-й или даже 8-й.

Окраска препаратов

При любой окраске срезов, залитых в парафин, их необходимо сна­чала освободить от него. Для этого срез кладут в ксилол и оставляют в нем до тех пор, пока парафин не растворится (приблизительно на сутки), затем проводят через спирты нисходящей концентрации (абсолютный спирт II, I, 96°, 80°, 70°), тщательно промывают в дистиллированной воде в трех ванночках, а затем уже кладут в краску.

А. Окраска клеточных элементов

Для окраски клеточных элементов в Институте мозга употребляют 2% раствор крезил-виолета, который окрашивает клеточные элементы в лиловый цвет. Фон остается бесцветным.

Как для мозга взрослого, так и для мозга эмбриона окраска проводится одинаково, эмбриональная ткань мозга хорошо окрашивается этим раствором.

Краска готовится следующим образом. 100 см3 дистиллированной воды подогревают до 28С, в нее опускают 2 г крезил-виолета; раствор хорошо взбалтывают, затем фильтруют в ванночку, куда опускают срез; ванночку с препаратом все время покачивают, чтобы окраска происходила равномерно. Если срез плохо воспринимает краску, рекомендуется раствор вместе с срезами подогревать до 50°. Окраску срезов эмбриональных мозгов лучше производить с подогреванием. Когда срез диффузно окрасится в темно-лиловый цвет, его дифференцируют в 96° спирту, меняя спирт раза три; дифференцировать лучше под контролем микроскопа—интенсивно окрашенные в лиловый цвет клеточные элементы на светлом фоне показывают, что дифференцировка закончена; срез перекладывают в чистый 96° спирт, затем в кайэпутовое масло и ксилол (в ксилоле долго держать не рекомендуется, так как препарат синеет); заключают срез в канадский бальзам под покровное стекло. При работе с эмбриональными срезами надо сначала проверить, нет ли на срезе сулемовых осад­ков. Если осадки имеются, срез, освобожденный от парафина, помещают в спирты, последовательно до 80°, затем перекладывают в 60°, куда при­бавляют несколько капель йодистой настойки (до получения желтого цвета). На следующий день препарат кладут в водопроводную воду до полного обесцвечивания, далее в 80° спирт, в дестиллированную воду (в трех ванночках), а затем красят как обычно.

Срок пребывания мозга эмбриона в спиртах , хлороформе и парафине  (в днях)

Таблица 2

Если окраска среза недостаточно равномерна, поступают следующим образом: окрашенный препарат из ксилола кладут в 96° спирт, а затем снова в кайэпутовое масло, в ксилол и канадский бальзам. При недостаточной окраске срез отмывают от краски и красят вновь.

Б. Окраска миэлиновых волокон

Существует много методов окраски миэлиновых волокон в централь­ной нервной системе. В Институте мозга пользуются методом Шпиль-мейера, Гейденгейна для окраски мозга, который не был предварительно хромирован, методом Кульчицкого-Паля—для  хромированных мозгов.

Метод Шпилъмейера

По методу Шпильмейера окрашиваются срезы, приготовленные на замораживающем микротоме, срезы головного мозга, фикси­рованные в формалине и залитые в целлоидин. В институте метод Шпильмейера употребляется для окраски препаратов полушарий голов­ного мозга, залитых в парафин. Окраска по этому методу производится следующим образом.

1. Срезы, залитые в целлоидин вынимают из 70° спирта, где они хранятся после резки, и промывают в дистиллированной воде.

2. На 24 часа кладут в 2,5% раствор железо-аммиачных квасцов.

3. Быстро промывают в дистиллированной воде.

4. Переносят на 10 минут в 70° спирт.

5. Переносят на 24 часа в раствор гематоксилина (1 см810% раствора гематоксилина, 9 см8 абсолютного спирта и 90 см8 дестиллированной воды. Гематоксилин должен быть приготовлен за несколько месяцев до упо­требления) .

6. Вынутые из краски срезы споласкивают в водопроводной воде.

7. Затем диференцируют в 2,5% растворе аммиачных квасцов до появления ясной разницы в окраске белого и серого вещества (белое вещество принимает синюю окраску,  а серое вещество—сероватую).

8. Срезы промывают в четырех ванночках с водопроводной водой, причем их можно оставить там на несколько часов (тогда они приобре­тают более интенсивный синий цвет). Затем их споласкивают в дестил­лированной воде.

9. Обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, переносят в карбол-ксилол и заключают в канадский бальзам под покровное стекло.

Для окраски препартов, залитых в парафин, срезы освобождают от парафина по указанному выше способу, а затем окрашивают по методу Шпильмейера.

Метод Кулъчицкого-Паля

Для окраски по методу Кульчицкого-Паля препараты должны быть фиксированы в жидкости Мюллера, залиты в целлоидин по описанному способу и нарезаны. Окраска производится следующим образом.

1. Срезы из 70° спирта, куда их кладут после резки, переносят в дистиллированную воду, а затем в 12—15% раствор двухромовокислого калия, приготовленного заранее, и помещают на 3—4 суток в термостат при температуре 37°.

2. После этого их промывают в водопроводной воде и в нескольких ванночках дистиллированной воды.

3. На 2—3 дня кладут в раствор гематоксилина и помещают в термостат при температуре 52—54°. Краску приготовляют месяца за три до употребления (чем старее краска, тем лучше) следующим образом. 60 г гематоксилина растворяют в 600 см3 абсолютного спирта и закрывают пробкой на 3 дня, затем прибавляют дистиллированной воды до 800 см3, 120 см3 уксусной кислоты и снова дистиллированной воды до 1000см3. Жидкость взбалтывают, бутылку завязывают марлей, оставляют без пробки и ставят на солнце.

4. Из краски срезы погружают на 2—3 минуты в жидкость Мюллера.

5. Промывают тонкой струйкой под краном и в двух ванночках дистиллированной воды.

6. Дифференцируют срезы следующим образом: а) на 2*/2 минуты кла­дут в 1 % раствор марганцовокислого калия; б) быстро промывают дестил­лированной водой; в) кладут в горячий раствор (10 г щавелевой кислоты, 10 г сернокислого натрия, 1000 см3 дестиллированной воды).

В этой жидкости препараты дифференцируют до тех пор, пока не появится разница в цвете белого и серого вещества—белое вещество будет окрашено в синий цвет, а серое—в сероватый.

Надо дифференцировать осторожно, чтобы не раскрасить миэлиновые волокна в коре. Если срез плохо диференцируется или на нем имеются желтые пятна, всю процедуру, начиная с марганцовокислого калия, повторяют опять до получения правильной окраски.

После краски срез надо особенно хорошо промыть, иначе в марганцо­вокислом калии могут образоваться осадки. Если срез вполне хорошо окра­сился, его промывают очень тщательно, сначала в дестиллированной воде, затем в водопроводной; в водопроводной воде его можно оставить до другого дня, как можно чаще меняя ее. После водопроводной воды срез на 10 минут снова кладут в дистиллированную воду, в которую приба­вляют 10 капель насыщенного углекислого лития, затем в чистую дестил­лированную воду, восходящие спирты, карбол-ксилол (в двух-трех ван­ночках, пока срез не погрузится на дно), быстро проводят через ксилол и заключают в канадский бальзам.

Окраска миэлиноеых волокон по способу Гейденеейна

При окраске по этому способу срезы, залитые в парафин, необхо­димо коллодинировать, так как под влиянием лития, входящего в состав краски, они сползают со стекла. Препараты освобождают от парафина, кладут в абсолютный спирт I и II, после чего коллодинируют (см. выше); срезы остаются на стекле, их промывают в трех ванночках с дестилли­рованной водой. Далее поступают так.

1. Кладут в протраву на 24—48 часов (протрава—2,5% раствор железо-аммиачного сульфата в холодной дестиллированной воде—приго­товляется заранее).

2. Промывают в трех ванночках с дести л л иро ванной водой.

3. Переносят в краску на 4 часа (состав краски: 10 см3 спиртового созревшего гематоксилина, 10 см3 дестиллированной воды, 7 см3 насы­щенного углекислого лития). Краску фильтруют. Во время окраски необходимо следить за препаратами. Если окраска плохо восприни­мается, надо прибавить еще лития, а иногда даже необходимо поставить препараты в термостат.

4. Препарат промывают в дестиллированной воде (можно оставить в ней до другого дня).

5. Погружают в 80°спирт до полного освобождения от лишней краски.

6. Обезвоживают в 96° и абсолютном спирту.

7. Переносят в карбол-ксилол, ксилол I, II.

8. Заключают в канадский бальзам под покровное стекло.

Окраска миэлиновых волокон по способу Марки

По способу Марки нормальные миэлиновые волокна не окрашиваются, воспринимают окраску только свежеперерожденные; когда миэлин начинает распадаться на свои составные части, выделяются жиры в виде капелек, круглых образований; они и окрашиваются в черный цвет осмием, который является составной частью способа Марки. Пучок перерожденных волокон, окрашенных в черный цвет, очень легко про­следить на далеком расстоянии от места разрушения; хорошо видны и отдельные волокна. Лучше всего окрашиваются волокна, начиная с 10-го дня их перерождения и до 3—4 недель, после чего нервные волокна уже не воспринимают окраску Марки.! В этих случаях приходится употреблять метод Шпильмейера, при котором окрашиваются сохра­нившиеся волокна, а участок, лишенный миэлина, остается неокра­шенным, что позволяет следить за ходом этого перерожденного пучка.

Чтобы получить хорошую окраску по способу Марки, необходимо брать очень тонкие, небольшие кусочки мозга и большое количество жидкости Марки, так как жидкость должна проникнуть в самую толщу кусочка и окрасить там все имеющиеся перерожденные волокна. Если жидкость не проникнет в глубину кусочка, окраску среза уже ничем не исправишь и препарат можно считать испорченным.

Для обработки по способу Марки берут из свежего мозга кусочек толщиной не более 0,3 см и длиной 1,5 см и кладут его на 7—10 суток в жидкость Мюллера; чтобы кусочек омывался со всех сторон жидкостью, его необходимо подвесить на ниточке или положить на стеклянную вату.

Из жидкости Мюллера кусочек переносят в жидкость Марки (одна часть 1% осмиевой кислоты и две части мюллеровской жидкости), кото­рая является и фиксатором, и красящим веществом.

Раствор осмиевой кислоты готовится непосредственно перед упо­треблением следующем образом. 

Ампулу с 1 г осмиевой кислоты слегка надрезают у одного конца и опускают в чисто вымытую темную баночку с притертой пробкой, плотно закрывают баночку пробкой и сильно ее встряхивают, чтобы разбить ампулу на мелкие кусочки и освободить кристаллы кислоты. Затем в баночку прибавляют 100 см3 дестиллиро­ванной воды, и осмиевая кислота быстро растворяется. В другую, более широкую баночку наливают, в зависимости от количества кусочков, двз части мюллеровской жидкости и одну часть осмиевой кислоты, затем в эту смесь из мюллеровской жидкости переносят кусочки. Их подвеши­вают или кладут на стеклянную вату. Класть много кусочков в одну баночку не следует, чтобы они не соприкасались и хорошо омывались жидкостью. Приготовлять осмиеву кислоту и смесь надо очень быстро, крепко прикрывая баночку притертой пробкой, чтобы сохранить пары, которые выделяет осмиева кислота, так как они являются главной актив­ной частью этого раствора; когда выделение паров прекращается, раствор уже не оказывает никакого действия на кусочки. Баночку ставят в тем­ное место в шкаф на 7—12 дней и каждые 3—4 дня подливают в нее 1 см* свежего 1% раствора осмия. После фиксации кусочки промывают в водопроводной воде и очень быстро проводят через спирты, ксилол и заливают в целлоидин (в течение 2—3 суток). Режут срезы толщиной 25—30 мкм, собирают их на пронумерованные бумажки и хранят в 70° спирту. Срезы, необходимые для изучения, быстро обезвоживают 96° абсолютным спиртом, просветляют в ксилоле и заделывают в канадский бальзам под покровное стекло или без него. Никакой дополнительной окраски не надо.

Метод Глисса

(в модификации А.Н. Владимировой)

Для окраски в нервных волокнах осевых цилиндров и нервных окончаний употребляют метод Глисса, модифицированный в лабора­тории Института мозга А. Н. Владимировой.

Этот метод заключается в следующем. ,

Небольшой кусочек мозга человека погружают в жидкость Бодиана (5 см3 формалина, 5 см3 ледяной уксусной кислоты и 90 см3 80° спирта) на 3—4 дня.

Мозг мелких животных погружают в эту жидкость целиком, а на другой день из него вырезают небольшой кусочек и снова кладут в жидкость Бодиана на те же сроки. Затем кусочки мозга в течение 24 часов промывают в текущей воде, режут на замораживающем микро­томе на срезы толщиной 12—15 мкм. Далее поступают следующим образом.

1. Срезы споласкивают в дистиллированной воде.

2. Кладут на 24 часа в 50°спирт, прибавляют в него 10 капель креп­кого аммиака.

3. Прополаскивают в дистиллированной воде.

4. Кладут в 10% азотнокислое серебро (argentum nitricum), пока срез не сделается коричневым (от нескольких часов до 5 дней).

5. Не споласкивая, кладут в 10% формалин, меняя несколько чашек.

6. Вынув из формалина, споласкивают в проточной воде.

7. Погружают на 30 секунд—1 минуту в смесь, состоящую из 10 см3 абсолютного спирта и 10 см3 20% азотнокислого серебра (получается осадок), прибавляют по каплям аммиак до растворения осадка.

8. Переносят препарат в 10% формалин (несколько чашек).

9. Промывают его в дестиллированной воде.

10. Кладут в 1% раствор хлорного золота до появления стального цвета (от несколько секунд до одной минуты).

11. Помещают в 5% гипосульфит.

12. Вынув из гипосульфита, тщательно промывают в дистиллированной воде.

13. Вылавливают на стекло, подсушивают на воздухе, затем про­водят через ацетон,  ксилол, канадский бальзам.

Метод Бильшовского

Для окраски осевых цилиндров и нервных окончаний, помимо метода Глисса, употребляется метод Бильшовского. Этим способом можно окрасить срезы, приготовленные на замораживающем микротоме толщи­ной 8—10 мкм или залитые в парафин. Окраска производится следующим образом.

1. После резки срезы кладут в дистиллированную воду. 

2. Затем в 2% раствор азотнокислого серебра на 24 часа (парафинов ые срезы—на 48 часов).

3. Прополаскивают в дестиллированной воде.

4. Переносят в аммиачное серебро на 20—25 секунд (парафино­вые срезы—на 30 минут). Аммиачное серебро приготовляют так. Берут 4 см8 раствора азотнокислого серебра и прибавляют к нему 3—4 капли 10% раствора едкого натра. Образуется осадок, который встряхивать не надо, а осторожно по каплям добавлять в него тройного аммиака и после каждой капли слегка встряхивать. Осадок постепенно начинает раство­ряться. Чем меньше прибавлено аммиака, тем лучше получается окраска (рекомендуется не более 10 капель). После растворения осадка в жид­кость добавляют до 20 см3 дистиллированной воды.

5. После аммиачного серебра срезы быстро споласкивают в дистиллированной воде и переносят в 20% кислый формалин, пока срез не потемнеет (на несколько секунд для замораживающих срезов и на 30 минут — для парафиновых).

6. Тщательно промывают в дистиллированной воде.

7. Кладут в хлорное золото до появления стального или красновато-фиолетового цвета. Хлорное золото готовят следующим образом. К 10 см3 дистиллированной воды прибавляют 5—6 капель 1% раствора хлорного золота и 5 капель уксусной кислоты (можно и без нее).

8. Срезы переносят на 30 секунд в 5% гипосульфит.

9. Тщательно промывают в дистиллированной воде.

10. Обезвоживают в восходящих спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в канадский бальзам под покровное стекло. Существует и другой способ заключения препаратов, чтобы избежать их сморщива­ния; этот способ заключается в следующем: после промывания в воде срез подсушивают фильтровальной бумагой, проводят через ксилол и заключают в канадский бальзам или в желатину.

Метод Голъджи

В гистологической лаборатории Института мозга(зав. Г.И. Поляков) при окраске клеток коры мозга плода со всеми отростками в класси­ческий метод Гольджи внесена некоторая модификация. При обработке мозга плода поздних месяцев внутриутробной жизни и мозга в первые месяцы после рождения берут кусочки небольших размеров. Окраску производят следующим образом.

1. Кусочки свежего мозга фиксируют в жидкости Мюллера в тече­ние 3—5 дней.

2. Переносят на 2—3 дня в хромосмий (600 см3 3% хромовой кислоты и 30 см3 1% осмиевой кислоты).

3. Затем кладут их в 0,75—1% азотнокислое серебро на 5 дней (и больше).

4. После этого кусочки обезвоживают в 70° спирту (15 минут), 96° спирту I (30 минут), 96°спирту II (30 минут) и абсолютном спирту (час). Помещают в жидкий целлоидин на 1 час, средний целлоидин на 1 час; в густом целлоидине оставляют на ночь.

5. Быстро заливают в целлоидин.

6. На следующий день режут (толщина срезов 90—120 мкм).

7, Обезвоживают срезы в спиртах восходящей концентрации, поме­щают в кайэпутовое масло, ксилол.

8. Заделывают в канадский бальзам без покровного стекла. Кусочки мозга плодов ранних стадий беременности кладут прямо в хромосмий, без предварительного помещения в мюллеровскую жидкость.

Метод этот капризный, редко удается, требует большого внимания и тщательности.

Для изучения цитоархитектонического строения коры головного мозга на препаратах, окрашенных крезил-виолетом, необходимо с этих препаратов приготовить проекции с увеличением в 2—3—4—5 раз. В Институте мозга употребляют увеличение в 5 раз, для чего пользуются проекционным аппаратом. При изучении препаратов под микроскопом на проекциях отмечают, какие поля имеются на данном срезе. Границы между полями, отмеченные на срезе (на стекле), для большей точности лучше переносить на проекции при помощи проекционного аппарата, а не отмечать на-глаз. Кроме того, на проекции надо отметить границу между свободной поверхностью извилины и бороздой.

Затем проекции поступают в лабораторию для измерения площади, занимаемой различными полями, отдельно площади на поверхности извилины и в борозде. Измерение производится специальным прибором—курвиметром; показываемые им цифры ставят на проекции недалеко от наме­ченных границ, как между полями, так и между стенкой борозды и сво­бодной поверхностью. На листе проекции сбоку выписывают поля, имеющиеся на этой проекции, и занимаемую ими площадь в бороздах, по поверхности и общую сумму; затем складывают площадь, занимаемую каждым полем на всех проекциях, в отдельности на поверхности, в бороздах и общую сумму. Чтобы узнать общую поверхность полушария, складывают площади всех полей. Получаемую сумму делят на 5 или на то число, во сколько раз была увеличена проекция. Полученное число и будет представлять поверхность полушария в квадратных миллиметрах.

При изучении среза под микроскопом недостаточно только описывать строение коры (например, кора широкая, верхний этаж шире нижнего, клетки крупные), а необходимо пользоваться также и измерительными методами исследования при помощи окуляр-микрометра.

Окуляр-микрометр имеет в центре линейку, разделенную на 5 рав­ных частей, из которых каждая в свою очередь делится на 10 частей. Размеры этих делений меняются в зависимости от величины окуляра и объектива, а поэтому прежде чем производить измерение, необходимо установить величину каждого деления при данном окуляре и объективе. Для этого пользуются объектив-микрометром—предметным стеклом, в центре которого находится микрометрическая линейка, разделенная на 10 частей, каждая из которых также разделена на 10; величина каждой из них известна—она равна 0,01 мм, так что вся линейка равна 1 мм. Это стекло вставляют под объектив на место препарата. Надо его поставить так, чтобы линейка в окуляре совпала с линейкой на предметном стекле, а затем отметить, какие соотношения получаются между делениями линеек. Зная величину каждого деления в объектив-микрометре, можно вычислить чему соответствует величина каждого деления в окуляр-микрометре. Затем объектив-микрометр заменяют препаратом и окуляр-микрометром, зная какой величине соответствует каждое из его делений, измеряют ширину коры, ширину каждого слоя, величину клеток. Ширина коры и ее слоев отмечается в миллиметрах, а величина клеток — в микронах. Для подсчета количества клеток пользуются сеткой (как для изучения кровяных шариков), подсчитывают их в нескольких местах одного и того же слоя и выводят среднюю величину.

В работах по цитоархитектонике коры большого мозга большей частью имеют значение не абсолютные цифры величины площади полей, клеток, ширины коры в общем и отдельных слоев в частности, а относи­тельные, например, процентное отношение площади полей к площади соответствующей области или к площади всего полушария; ширина коры поля к ширине коры того же поля в другом мозгу; ширина слоев к ширине всей коры.

Полученные относительные величины позволяют судить объективно об индивидуальном различии одного мозга от другого или дают представление о закономерностях развития коры большого мозга.

При изучении цитоархитектоники коры большого мозга необходимо отмечать для фотографии те места, которые наиболее характерны для данного поля. При этом надо обращать внимание, чтобы на срезе не было никаких даже небольших дефектов, так как на фотографии они достигают очень больших размеров.