КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ

Ускоренный метод окрашивания миелиновых волокон и нервных клеток по Викторову

Депарафинированные срезы окрашивают в течение 1 —2 ч в 0,01 % кислом спиртовом растворе люксолевого синего прочного, дифференцируют в 0,1 % растворе тетрабората натрия (буры) и докрашивают крезиловым фиолетовым прочным по Нисслю.

Растворы красителей и их изготовление. 

Раствор I: 1 г люксолевого синего прочного, 5 мл ледяной уксусной кислоты, до 100 мл 96 % спирта. Для приготовления рабочего 0,01 % раствора

1 мл основного раствора красителя смешивают со 100 мл 96 % спирта. Рабочий раствор красителя можно использовать повторно.

Раствор II: 250 — 500 мг крезилового фиолетового прочного, 130 мг ацетата натрия, 1,2 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды. Забуференный раствор крезилового фиолетового прочного для подкрашивания по Нисслю можно использовать неоднократно.

Методика окраски

1. Наклеенные на стекла парафиновые срезы толщиной 10 — 20 мкм депарафинируют в ксилоле и промывают в 100 % и 96 % спиртах.

2. Окрашивают в 0,01 % спиртовом растворе люксолевого синего прочного 1 — 2 ч при 56 — 60 °С.

3. Промывают срезы последовательно в 96 % и 70 % спиртах и дистиллированной воде.

4. Дифференцируют в 0,1 % растворе тетрабората натрия, контролируя процесс под микроскопом (краситель постоянно удаляется из среза, а миелиновые волокна сохраняют яркую сине-зеленую окраску).

5. Ополаскивают в 5 % растворе уксусной кислоты.

6. Окрашивают крезиловым фиолетовым прочным в течение 2 — 5 мин.

7. Промывают в дистиллированной воде.

8. Обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %), просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Результат: миелин ярко-синего цвета; вещество Ниссля, ядра нейронов, глиоцитов, клеток сосудов и оболочек мозга фиолетовые.

Метод избирательной импрегнации дегенерированных нервных волокон и окончаний

Фиксацию мозга лабораторных животных проводят методом прижизненной перфузии 10 % раствором нейтрального формалина на изотоническом растворе хлорида натрия через левый желудочек сердца. После перфузии мозг дополнительно фиксируют в течение 10—14 дней в 10 % растворе нейтрального формалина, а за 1 — 2 дня перед резкой помещают в 30 % раствор сахарозы, что предупреждает повреждение ткани при замораживании. В растворе формалин-сахарозы мозг может храниться долго.

Срезы толщиной 25 — 40 мкм, полученные на замораживающем микротоме, собирают в 10 % раствор формалина, в котором и хранят до последующей обработки.

Растворы и их приготовление. 

А. Кислый раствор соли пятивалентного ванадия: навеску в 1,2 г метаванадата аммония (аммоний ванадиевокислый) растворяют в 150 — 200 мл горячей дистиллированной воды, после охлаждения раствора к нему добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты и доводят его объем до 1000 мл. Удобно готовить также концентрированный раствор: 12 г метаванадата аммония растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды. К полученному раствору после охлаждения небольшими порциями добавляют 50 мл концентрированной серной кислоты и доводят его объем до 1000 мл. Если при добавлении серной кислоты выпадает бурый осадок пятиокиси ванадия, то его растворяют при нагревании. Перед применением к 1 части концентрированного раствора добавляют 9 частей дистиллированной воды. Кислый раствор метаванадата аммония может храниться в течение длительного времени. 

Б. Раствор нитрата серебра 3 %.

В. Аммиачно-натриевый раствор: в 100 мл 25 % водного раствора аммиака растворяют 1,25—1,5 г гидроксида натрия. Раствор хранят в плотно закрытой склянке с полиэтиленовой пробкой.

Г. Раствор аммиачного серебра (готовят перед использованием): к 50 мл 3 % аммиачного серебра добавляют 6 мл аммиачно-натриевого раствора.

Д. Редуцирующий раствор: 27 мл 10 % формалина, 87 мл 1 % лимонной кислоты, 90 мл 96 % спирта, до 1000 мл дистиллированной воды.

Е. Смесь равных объемов 1 % раствора тиосульфата натрия и 1 % раствора сульфита натрия.

Импрегнация срезов

1. Срезы промывают в течение 5 мин в 2 сменах дистиллированной воды.

2. Помещают в кислый раствор метаванадата аммония на 10— 15 мин.

3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды 5 мин.

4. Переносят на 25 — 30 мин в 3 % раствор нитрата серебра (срезы приобретают светло-коричневый цвет). Далее каждый срез обрабатывают отдельно.

5. Ополаскивают в дистиллированной воде (5— 10 смен).

6. Помещают на 1 — 2 мин в раствор аммиачного серебра.

7. Без предварительного промывания проводят через 2 смены редуцирующего раствора (1-я смена — 1 мин, 2-я смена — 2 — 3 мин).

8. Промывают 1 — 2 мин в дистиллированной воде.

9. Помещают на 1 — 2 мин в смесь равных объемов 1 % растворов тиосульфата натрия и сульфита натрия.

10. Тщательно промывают в 2 сменах дистиллированной воды в течение 10—15 мин.

11. Промытые срезы наклеивают на предметные стекла спиртовым раствором желатина и хромовых квасцов (в 200 мл 0,5 % раствора желатина растворяют 100 мг хромовых квасцов; чистые предметные стекла погружают в этот раствор, вынимают и сушат в вертикальном положении). Наклеенные и хорошо просушенные срезы обезвоживают спиртом, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Примечания. 

1. Продолжительность обработки срезов, описанной в пунктах 2, 4, 6, определяют опытным путем для каждой серии срезов.

2. Качество препаратов значительно улучшается, если срезы, наклеенные на предметные стекла, докрасить растворами крезилового фиолетового прочного или толуидинового синего.

Результат: фон препаратов светло-желтый, реже коричневый; дегенерированные волокна — черные; в местах окончания дегенерированных волокон выявляют тела нервных клеток и ядра нейроглии, имеющие различные оттенки фиолетового цвета.

Методика дифференцированного выявления нейронов и глии на парафиновых срезах

Гистохимические методы, в частности методы определения белковых веществ, не позволяют дифференцировать типы глии, поскольку обычно у глиальных клеток различимы только структу­ры ядра. Ставя задачу разработать метод дифференцированно­го определения нейронов и глиальных элементов на гистохимических препаратах, авторы попытались объединить метод Альцгеймера, предназначенный для выявления митохондрий, нейросом, телец Ниссля и астроцитарной глии, и гистохимический  метод определения общего белка с применением амидо черного 10Б. Метод Альцгеймера основан на различном сродстве органоидов клетки к красителям: в нейронах митохондрии и нейросомы окрашиваются в ярко-красный цвет, вещество Ниссля — в зеленый, а тела амебовидных клеток — в зеленоватый, глиальные и соединительнотканные волокна — в красный. Метод с применением амидо черного 10Б позволяет обнаружить общий и суммарный белок в ткани мозга по окрашиванию его скоплений в зеленый цвет. В результате исследования разработана следующая схема.

Кусочки ткани мозга после фиксации в жидкости Карнуа проводят по обезвоживающим средам и заключают в парафин. Срезы толщиной 5—10 мкм приклеивают белком на предметные стекла.

1. Срезы депарафинируют и через спирты нисходящей концентрации доводят до воды.

2. Переносят в 0,03 % раствор амидо черного 10Б на ацетатном буфере (рН 5,32) при комнатной температуре на 20 мин.

3. Промывают в дистиллированной воде.

4. Инкубируют в насыщенном водном растворе кислого фуксина при 56 °С 30 мин.

5. После охлаждения до комнатной температуры ополаскивают в дистиллированной воде.

6. Дифференцируют в пикриновой кислоте (15 мл насыщенного спиртового раствора пикриновой кислоты и 30 мл дистиллированной воды) 15 с.

7. Ополаскивают в дистиллированной воде и обсушивают фильтровальной бумагой.

8. Дифференцируют в 100 % спирте около 2,5 с.

9. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Результат: отчетливо выявляются белки в телах и митохондриях нейронов, а также в ядрах глиальных клеток. Последние значительно различаются по интенсивности окраски в зависимости от принадлежности к тому или иному типу глии: кариоплазма и хроматиновые структуры ядер олигодендроглиоцитов интенсивно-красного цвета, а у астроцитов в красный цвет окрашены ядрышко и небольшое количество зерен хроматина.

Метод Герлаха

Для выявления грубых отростков ганглиозных клеток и более крупных тяжей волокон рекомендуется метод Герлаха. При этом важно, чтобы препараты до окрашивания кармином не соприкасались со спиртом.

Материал фиксируют в жидкости Мюллера или 3 — 5 % растворе бихромата калия. Продолжительность фиксации мозга птиц и лягушек составляет несколько недель, головного и спинного мозга человека — несколько месяцев и даже лет. Срезы получают на замораживающем микротоме и в течение нескольких часов промывают в воде. Окрашивают в разбавленном растворе аммиачного кармина 24 — 48 ч. Очень важно правильно приготовить раствор: растирают 1 г кармина, приливают 100 мл дистиллированной воды и добавляют по каплям 26 % раствор аммиака (нашатырный спирт) в таком количестве, чтобы краситель полностью растворился. После этого раствор должен созреть в открытом сосуде до полного исчезновения запаха аммиака. К употреблению годны лишь растворы, стоявшие в течение длительного времени. Перед использованием основной раствор разбавляют дистиллированной водой настолько, чтобы для окрашивания срезов потребовалось 24 — 48 ч. Раствор кармина можно использовать повторно (со временем он даже становится лучше). Срезы дифференцируют в слабо подкисленной уксусной кислотой воде 1 — 2 ч; промывают, проводят через спирты возрастающей концентрации, ксилол и заключают в бальзам.

Результат: ганглиозные клетки с отростками интенсивно-красные; осевые цилиндры нервных волокон и ядра клеток красные; волокна глии розовые; мякотные оболочки остаются неокрашенными. Если срез предварительно окрасить гематоксилином, то ядра окрашиваются контрастно в синий цвет.