|
Общие реакции на белок
Окраска суммарного белка бромфеноловым синим по Бонхегу
1. Материал фиксируют в 1 % формалине, жидкости Карнуа, заливают в парафин или получают криостатные срезы.
2. Доводят парафиновые срезы до воды.
3. Окрашивают в течение 2 ч при комнатной температуре в 2 % водном растворе уксусной кислоты с 1 % раствором сулемы и 0,05 % раствором бромфенолового синего.
4. Промывают срезы в течение 5 мин в 0,5 % уксусной кислоте.
5. Переносят непосредственно в терет-бутанол.
6. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам или синтетическую среду.
Результат: белки окрашиваются в темно-синий цвет.
==========================================================================
Диазониевая реакция Паули
и методы тетразониевого сочетания по Даниелли
В 1904 г. Pauli предложил использовать в качестве реагента на тирозин и гистидиндиазобензолсульфокислоту, которая относится к классу диазосоединений, содержащих диазогруппу. Изомер диазогруппы, состоящий из трех- и пятивалентного атомов азота, называемый диазонием, определяет высокую реактивность диазосоединений.
Диазосоединения вступают в реакцию азосочетания с ароматическими аминами, фенолами и нафтолами с образованием азокрасителя, и их широко применяют в промышленном производстве красителей.
Диазобензосульфокислота в щелочных растворах взаимодействует с фенольной группой тирозина, индольной группой триптофана и гетероциклической имидазольной группой гистидина с образованием окрашенных продуктов реакции. Применив эту реакцию в гистологических исследованиях, Danielli (1947) нашел ее недостаточно интенсивной, поэтому он в качестве индикатора вместо диазосоединений использовал тетразососдинения, т.е. соединения, содержащие две диазогруппы. В качестве таковых он применил двойные диазониевые соли — тетразотированный бензидин или его диметоксипроизводное — тетразотированный о-дианизидин (прочный синий В).
Этот широко используемый в гистохимии метод тетразониевого сочетания по Даниелли основан на взаимодействии аминокислот, в частности тирозина, триптофана и гистидина, с тетразотированным бензидином и последующем сочетании оставшейся свободной диазогруппы с Betta-нафтолом или Н-кислотой.
==========================================================================
Реакция тетразониевого сочетания по Даниелли
в модификации Кисели
Готовят 40 % раствор параформальдегида, растворяя 40 г порошка формальдегида в 100 мл дважды дистиллированной воды при нагревании до 65 °С с постоянным помешиванием.
1. Материал фиксируют в 1 % формалине, спирте, с помощью лиофильной сушки, наиболее пригодна фиксация по Карнуа.
Заливают в парафин.
Полученные срезы толщиной 5-7 мкм депарафинируют, промывают в дистиллированной воде и веронал-ацетатном буфере (рН, 9,2).
2. Обрабатывают свежем тетразотированным бензидином на ледяной бане в течение 20 мин.
Тетразотированный бензидин готовят следующим образом:
18 мг бензидина растворяют с добавлением 0,83 мл концентрированной соляной кислоты в 50 мл дистиллированной воды.
Раствор охлаждают на ледяной бане, затем добавляют 14 мг нитрита натрия, растворенного в 1 мл дистиллированной воды, и в течение 10 мин часто помешивают, затем подщелачивают 10 — 20 % раствором гидроксида натрия или калия до рН 9,0. В процессе подщелачивания раствор приобретает коричневый цвет. Срезы помещают в щелочной раствор тетразотированного бензидина. Этот раствор нестоек, и его следует использовать сразу после приготовления. Вместо него можно использовать 0,2 % водный раствор прочного синего В в трис-НС1-буфере (рН 9,2); инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
3. Промывают дистиллированной водой, затем охлажденной 0,1 н. соляной кислотой и вновь дистиллированной водой.
4. Проводят реакцию азосочетания в веронал-ацетатном буфере (рН 9,2), насыщенном (betta-нафтолом или Н-кислотой в течение 15 мин.
5. Промывают дистиллированной водой, затем 1 % уксусной кислотой и вновь дистиллированной водой.
6. Обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам или дистрен- дибутилфталат ксилол.
Результат:
белки тканей окрашиваются в различные оттенки красновато-коричневого цвета.
При использовании betta-нафтола обезвоживание следует проводить быстро. После фиксации в формалине интенсивность реакции немного уменьшается, так как атомы водорода ароматических колец тирозина, триптофана, гистидина и фенилаланина необратимо блокируются формальдегидом.
==========================================================================
Реакция с динитрофторбензолом для выявления общего белка
по Даниелли
2,4-Динитрофторбензол (ДНФБ) реагирует количественно со свободными аминогруппами белков, 1-группами лизина, фенольными ОН-группами тирозина, имидазольными группами гистидина. Соединения с тирозином и гистидином бесцветны, а соединения со свободными аминогруппами имеют слабо-желтую окраску. ДНФБ может также реагировать с SH-группами, но эта реакция, по-видимому, не стехиометрична. ДНФБ можно использовать как блокирующий агент для всех указанных реактивных групп.
Реакция с динитрофторбензолом для выявления общего белка по Даниелли в модификации Берстона
1. Материал фиксируют в спирте, ацетоне, формальдегиде, заливают в парафин.
2. Промывают депарафинированные срезы в спирте.
3. Обрабатывают 1 % раствором ДНФБ в 90 % спирте, содержащем 0,01 н. (0,04 %) гидроксида натрия, при комнатной температуре 20 — 24 ч.
4. Промывают в четырех сменах 90 % спирта.
5. Промывают в дистиллированной воде.
6. Восстанавливают 5 % дитионитом натрия 40 мин при 45-60 °С (при этом желтая окраска обесцвечивается; при комнатной температуре продолжительность восстановления нитро-групп больше).
7. Для диазотирования помещают срезы на 5 мин при температуре от 0 до 4 °С в следующий раствор:
3 мл 10 % серной кислоты доводят до 50 мл 5 % нитритом натрия (растворы перед сливанием следует охладить до 4 °С).
8. Промывают в дистиллированной воде.
9. Обрабатывают холодным (4 °С) веронал-ацетатным буфером (рН 9,2),
насыщенным Н-кислотой или betta-нафтолом, 15 мин.
10. Промывают в дистиллированной воде и 70 % спирте, содержащем 1 % соляную кислоту.
11. Обезвоживают, просветляют в ксилоле и заключают в синтетическую среду.
Результат:
положительная реакция выражается в образовании комплекса азокрасителя красновато-оранжевого цвета. Поскольку выявляемые группы встречаются повсюду, окрашивание наблюдается во всем срезе. Интенсивно окрашиваются эластические, коллагеновые волокна и эритроциты.
| 
