|
ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
Выделение мононуклеаров периферической крови
1. Готовят градиент. В центрифужную пробирку (объем 10—15 мл) с пробкой вносят примерно 3 мл смеси метризоат — фиколл . Пробирку оставляют на столе до тех пор, пока градиент не примет комнатную температуру. (При 4°С работать не рекомендуется.)
2. Берут кровь. Переливают ее в коническую колбу, в которой находится дюжина стеклянных бус диаметром 2 мм. Колбу осторожно вращают кистью руки до тех пор, пока уже не будут слышны удары стеклянных бус друг о друга и о стенку колбы, т. е. пока кровь не свернется. (Не следует забывать об инфекционной опасности, которую представляет кровь человека.)
3. Разбавляют дефибринированную кровь равным объемом среды (PBS или BSS) при комнатной температуре.
4. С помощью пастеровской пипетки аккуратно наслаивают разбавленную дефибринированную кровь на градиент. Кончик пипетки загнут под углом 90° и отрезан алмазным ножом вблизи изгиба, чтобы избежать при наслаивании перемешивания градиента с кровью. (Можно поступить иначе. Вначале поместить дефибринированную кровь в чистую центрифужную пробирку, а затем подслоить под нее смесь метризоат — фиколл.)
5. Центрифугируют при 1500 g- в течение 15 мин., при комнатной температуре. (Во избежание перемешивания для остановки ротора центрифуги не следует пользоваться тормозом.)
6. Эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, а на границе раздела фаз находятся мононуклеарные клетки. Отсасывают прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем мононуклеаров. Затем по всей площади сечения пробирки на границе раздела фаз собирают слой мононуклеаров. Клетки, прилипшие к стенкам, можно собрать кончиком пипетки. Мононуклеары переносят в чистую центрифужную пробирку.
7. Разбавляют взвесь мононуклеаров не менее чем четырехкратным избытком среды и тщательно перемешивают. С этого момента обработку клеток можно проводить при 4 °С. Чтобы сконцентрировать МПК, взвесь центрифугируют при 300 g в течение 10 мин.
|
| |
Метризоат — фиколл,
изопак — фиколл,
гипак — фиколл
|
Например, для разделения клеток крови человека в градиенте плотности используют 9%-ный (вес/объем) раствор фиколла, чтобы приготовить градиент с плотностью 1,078 г/мл. Для разделения клеток крысы готовят 14%-ный (вес/ объем) раствор фиколла, чтобы окончательно градиент имел плотность 1,087 г/мл. Фиколл растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. К 24 объемам растворенного фиколла добавляют 10 объемов 32,8%-ного (вес/объем) раствора метризоата натрия
В качестве градиента плотности для разделения клеток крови можно использовать коммерческий препарат фиколл-400 (“Sigma-Aldrich” Швеция) или смесь фиколла с рентгеноконтрастными веществами с высокой плотностью (урографин, верографин, уротраст или изопак).
Фиколл – это фирменное название синтетического высокомолекулярного сополимера сахарозы и эпихлоргидрина. В иммунологических исследованиях используют 6,1%-или 9%-ные растворы фиколла с молекулярной массой 400 кДа (Фиколл 400). Для приготовления раствора фиколла его растворяют в теплой дистиллированной воде.
Приготовление градиента плотности фиколл-верографина
1. Подготовка фиколла: 4.32 (8.64) г порошка фиколл-400 растворяют в 48 (96) мл дистиллированной воды.
2. Подготовка раствора рентгеноконтрастного вещества (в частности, верографина): 10.14 (20.28) мл 76% раствора верографина доводят дистиллированной водой до 21 (42) мл.
3. Подготовка градиента плотности: растворы фиколл-400 и верографина смешивают. С помощью ареометра измеряют плотность полученного раствора, которая должна составлять 1.077 г/см. Если плотность выше, чем необходимо, то добавляют раствор фиколл-400, если ниже - раствор верографина. Градиент плотности можно хранить в течение 30 суток при температуре + 4˚С в склянке из оранжевого стекла.
При отсутствии фиколл-400 градиент плотности можно приготовить только из одного рентгено-контрастного вещества. С этой целью 10 (20) мл 76% раствора верографина смешать с 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и добавить 0.45 (0.9) мл. фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Полученный при этом 14.3% раствор верографина имеет плотность 1.077 г/см и может быть использован в качестве градиента плотности.
Следует отметить, что при применении метода седиментации в градиенте плотности для выделения лимфоцитов из общей суспензии форменных элементов крови необходимо использовать кровь доноров или животных, освобожденную от фибрина.
| |
Трипановый синий
|
Готовят 0,2%-иый раствор красителя в PBS, содержащий 3 мМ NaN3, при продолжительном перемешивании. Перед использованием раствор центрифугируют для удаления агломератов красителя.
| |
Натрий-фосфатный буфер. Phosphate buffered saline, PBS
|
Для приготовления 1 литра однократного натрий-фосфатного буфера используют:
8,00 г NaCl
0,20 г KCl
1,44 г Na2HPO4
0,24 г KH2PO4
растворяют в 800 мл дистиллированной воды доводят рН до 7,4 соляной кислотой или гидроксидом натрия добавляют дистиллированной воды до 1 литра.
PBS 1x
pH(1x)=7.3, (хранить при NT или при 4оС)
|
1x
|
100ml
|
500ml
|
1000ml
| |
KH2PO4
|
136.1g/M
|
0.272g
|
2.72g
| |
Na2HPO4x7H2O
|
268.1g/M
|
2.68g
|
26.8g
| |
NaCl
|
58.44g/M
|
8.0g
|
80g
| |
KCl
|
74.56g/M
|
0.20g
|
2.013g
| |
H2O
|
mQ
|
|
|
*стерилизовать автоклавированием;
*pH зависит от концентрации, поэтому измерять лишь разбавив до 1х;
*pH 10x должен быть ~6.8 (если необходимо, можно довести NaOH). Стерилизовать автоклавированием. После разбавления pH должен стать 7.4.
|
|
|
|
|
Выделение мононуклеарной
фракции крови и костного мозга по методу Boyum
(Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow //Scand.J.Clin.Lab.Investig.-1968.-Vol.21-Suppl.97.p.1-9)
Принцип метода
Принцип метода основан на различии в плавучей плотности форменных элементов крови. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества изопак или верографин создает градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании разделить клетки периферической крови и костного мозга на мононуклеарную фракцию (МФ), в которую входят лимфоциты, субпопуляция моноцитов и бластные гемопоэтические клетки, и фракцию, содержащую гранулоциты и эритроциты. МФ обладают меньшей, чем градиент, плотностью и располагаются над градиентом. Плотность гранулоцитов и эритроцитов больше, чем плотность градиента, они проходят через градиент, опускаясь на дно пробирки.
Методика МФ выделяют из гепаринизированной крови или костного мозга (7-10 МЕ гепарина/мл для крови и 20 МЕ гепарина/мл для костного мозга).
Костный мозг разводят физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:5; кровь, в соотношении 1:2 или 1:3.
Разведенную физиологическим раствором кровь или костный мозг центрифугируют в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharma cia Fine Chemicals, Швеция), плотность 1,077 г/мл (Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А.)
Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл //Лаб.дело, 1973.-10.-с.579-581) при 400g в течение 30 мин.
Полученную МФ трижды отмывают в ЗФФР (физиологический раствор, забуференный с помощью фосфатно-солевого буфера) и ресуспендируют в среде RPMI-1640 (Flow Laboratories, Англия) в концентрации 106 клеток в мл.
Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим (Ланг Н.Р. Стимуляция лимфоцитов //М.:Медицина, 1976.-288 с.) превышает 96%.
|
