Реакции на аминогруппы 

Реакция нингидрин-Шифф

Под действием нингидрина происходит окислительное дезаминирование аминокислоты белков с образованием углекислоты, альдегида и красителя. Этот краситель голубовато-фиолетового цвета легко подвержен диффузии, легко распадается и не удовлетворяет современным гистохимическим требованиям. Однако можно использовать окислительные свойства нингидрина и выявить образующиеся альдегидные группы с помощью реактива Шиффа. Наряду с нингидрином можно использовать аллоксан и другие окислители, например гипохлорит натрия и хлорамин Т.

==========================================================================

Нингидрин-Шифф(аллоксан-Шифф)-реакция 

для выявления NH2-групп по Яшуме и Ичикаве

1. Материал фиксируют в жидкостях Карнуа, Ценкера, этиловом спирте с 5 % уксусной кислотой, заливают в парафин.

2. Депарафинируют срезы и промывают в 2 сменах 100 % спирта.

3. Обрабатывают 0,5 % нингидрином или 1 % раствором аллоксана в 100% спирте (16-20 ч при 37 °С).

4. Промывают проточной водой 2-5 мин.

5. Переносят в реактив Шиффа на 30 мин при комнатной температуре.

6. Промывают в 3-4 сменах смеси, состоящей из 200 мл дистиллированной воды, 10 мл 10 % гидросульфита натрия и 10 мл 1 н. соляной кислоты 2 мин.

7. Промывают проточной водой 10 мин.

8. Обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле; заключают в бальзам.

Результат: 

NН2-группы, связанные с белком, приобретают окраску от красной до красно-фиолетовой.

Примечание: 

П. 6 можно опустить. После п. 7 можно провести докрашивание ядер, например гемалауном. Поскольку NН2-группы широко представлены в белках, реакции с нингидрином или аллоксаном можно использовать также для ориентировочного изучения распределения белков.

Этот методический подход с использованием образующихся на промежуточном этапе альдегидных групп широко применяют в гистохимии, например при выявлении ДНК, полисахаридов и ряда ферментов, катализируюших реакции с образованием альдегидов.

==========================================================================

Гистохимическое выявление тирозина: 

реакция Миллона в модификации Бейкера

1. Материал фиксируют в формальдегиде, заливают в парафин или целлоидин.

2. Депарафинированные срезы проводят через 50 % спирт до дистиллированной воды. Целлоидиновые срезы толщиной 20-30 мкм проводят так же.

3. Помещают в стеклянный сосуд с реактивом Миллона: к 100 мл 10 % раствора серной кислоты добавляют 10 г сульфата ртути (II), при нагревании растворяют; раствор охлаждают и доводят дистиллированной водой до 200 мл; к 5 мл этого раствора перед использованием добавляют 0,5 мл 0,25 % раствора нитрита натрия и нагревают до кипения.

4. Охлаждают до комнатной температуры в течение нескольких минут.

5. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды по 2 мин.

6. Заключают в глицерин-желатин или обезвоживают в спирте и заключают в бальзам через ксилол.

Результат: 

положительная реакция проявляется красным или желтовато-красным окрашиванием, интенсивность которого зависит от количества тирозина в структурах, содержащих белок.

==========================================================================

Гистохимическое выявление триптофана: 

реакция с диметил-аминобензальдегид-нитритом по Адамсу

1. Материал фиксируют в 4-10 % формалине 4-12 ч; в 80 % спирте с 1% трихлоруксусной кислотой 24 ч, заливают в парафин.

2. Депарафинированные в ксилоле срезы проводят через 100 % спирт, просушивают при температуре 30-40 °С.

3. Обрабатывают 50 % n-диметиламинобензальдегидом в концентрированной соляной кислоте 1 мин.

4. Помещают в 1 % нитрит натрия в концентрированной соляной кислоте на 1 мин.

5. Промывают срезы в проточной воде 30 с.

6. Быстро промывают в 1 % солянокислом спирте.

7. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.

Результат: 

белки, содержащие триптофан, окрашиваются в темно-синий цвет различной интенсивности; интенсивно окрашиваются гранулы клеток Панета, гранулы пепсиногена в главных клетках желез желудка, зимогенные гранулы экзокринных клеток поджелудочной железы, мышцы, фибрин, фибриноген, нейрокератин, чехлы волосяных луковиц.

Примечание: В п. 2 вместо высушивания можно после удаления спирта покрывать срезы тонкой пленкой целлоидина (0,25 % раствор целлоидина в смеси спирта с эфиром в соотношении 1:1). Для приклеивания срезов более пригоден хромат-желатин, чем белок-глицерин.

==========================================================================

Гистохимическое выявление аргинина: 

реакция Сакагучи для выявления аргинина в модификации Бейкера

1. Материал фиксируют в жидкостях Ценкера, Буэна, Карнуа, «Суза» (допустима также фиксация в нейтральном формалине), заливают в парафин.

2. Депарафинированные в ксилоле или толуоле срезы после обработки 100 % спиртом покрывают тонкой пленкой целлоидина (1 % раствор целлоидина в смеси спирта с эфиром 1:1) и уплотняют в 70 % спирте.

3. Доводят через 50 % спирт до дистиллированной воды и тщательно промывают.

4. Извлеченные из воды срезы высушивают на воздухе.

5. Обрабатывают 15 мин раствором а-нафтол-гипохлорита натрия, который готовят непосредственно перед использованием: к 4 мл 1 % гидрооксида натрия добавляют 4 капли 1 % а-нафтола на 70% спирте и 8 капель 1 % гипохлорита натрия. 

Реакция окрашивания развивается в реакционной смеси постепенно.

6. Сливают реактив с предметного стекла, препараты осторожно просушивают фильтровальной бумагой и помещают на 3 мин в смесь высушенного пиридина и безводного хлороформа.

7. Заключают под покровное стекло в смесь пиридина с хлороформом или в безводный пиридин. Поскольку сохранность таких срезов непродолжительна, рекомендуют просматривать и фотографировать их сразу после приготовления.

Результат: 

белки, содержащие аргинин, окрашиваются в оранжевый цвет разных оттенков.

Примечание. 

При интерпретации результатов реакции следует учитывать, что: 

а) стабильность окраски низка; 

б) для проявления окрашивания требуется гипохлорит, который, однако, мешает реакции образования красителя; 

в) щелочная реакционная среда оказывает разрушающее действие на ткань; 

г) точная локализация реакции затруднена из-за возможной диффузии продукта.

==========================================================================

Реакции на связанные с белками 

дисульфидные (цистин) и сульфгидрильные (цистеин) группы

Значение гистохимического выявления сульфгидрильных (SH=) и дисульфидных (-S=S-) групп определяется наличием в белковых молекулах цистина и цистеина. Свободные сульфгидрильные группы в тканях легко окисляются, частично под влиянием гистологической фиксации, поэтому количественно оценивать их содержание следует с осторожностью.

Гистохимическое выявление серосодержащих аминокислот возможно только для цистина и цистеина, связанных с белковыми молекулами и присутствующих в достаточно высокой концентрации. Свободный цистин и цистеин, а также глутатион гистохимически не выявляются, так как они присутствуют в очень низких концентрациях и вымываются из тканей в процсе их обработки.

Гистохимические реакции, направленные на определение сульфгидрильных групп, могут быть применены в случае дисульфидных групп, но при этом последние перед проведением гистохимической реакции должны быть восстановлены до сульфгидрильных групп.

Совместное и раздельное выявление сульфгидрильных и дисульфидных групп возможно с помощью диоксидинафтилди-сульфид-реакции (ДДД-реакции) на трех параллельных препаратах (срезах): на первом выявляются свободные реактивные сульфгидрильные группы; на втором дисульфидные группы восстанавливаются до сульфгидрильных (например, тиогликолатом натрия, цианидом калия, сульфидом аммония, аскорби­новой кислотой и др.), и выявляют их вместе; на третьем свободные сульфгидрильные группы блокируют (например, ацетилиодидом или N-этилмалеимидом), а дисульфидные группы восстанавливают до сульфгидрильных в условиях сохранения блокирования имеющихся свободных сульфгидрильных групп. Сопоставление таких препаратов дает представление о локализации сульфгидрильных и дисульфидных групп.

Метод выявления сульфгидрильных групп Баррнетта-Зелигмана основан на том, что в щелочной среде дисульфиды избирательно окисляют только тиоловые группы в белках. Дисульфидный реагент — 2,2'-диокси-6,6'-динафтилдисульфид специфически реагирует с сульфгидрильными группами фиксированных белков при рН 8,5 с образованием комплекса, не растворимого в воде и органических растворителях. После тщательного отмывания непрореагировавшего реагента и побочных продуктов (6-тио-2-нафтол) образовавшийся комплекс преобразуют в азокраситель путем сочетания с солью диазония, например тетразотированным диортоанизидином (прочным синим В).

==========================================================================

ДДД-реакция для выявления связанных с белком 

сульфгидрильных групп по Баррнетту—Зелигману

1. Материал фиксируют 24 ч в смеси трихлоруксусной кислоты и спирта (1 % трихлоруксусная кислота в 80 % спирте), жидкости Карнуа, формалине.

2. Быстро заливают в парафин (лучше в вакуумном сушильном шкафу); парафиновые срезы прикрепляют небольшим количеством смеси белка и глицерина на предметное стекло.

3. Срезы депарафинируют и через спирт понижающейся концентрации доводят до дистиллированной воды.

Варианты: срезы, депарафинированные в ксилоле, промывают в 100 % спирте и покрывают 0,5 % целлоидином (0,5 г целлоидина растворяют в 100 мл смеси 100 % спирта с эфиром в соотношении 1:1). Тонкую пленку целлоидина на срезах просушивают, уплотняют в 70 % спирте, переносят срезы в дистиллированную воду.

4. Срезы обрабатывают (в кювете) ДДД-реагентом (50 мг 2,2-диокси-6,6-динафтилдисульфида + 30 мл 100 % спирта + 70 мл натрий-веронального буфера, рН 8,5) при 50 "С 1 ч.

5. Кювету со срезами охлаждают при комнатной температуре +10 мин.

6. Быстро промывают срезы в дистиллированной воде, затем промывают 10 мин в дважды сменяемой дистиллированной воде, подкисленной до рН 4,0-4,5 уксусной кислотой.

7. После проведения через ряд спиртов возрастающей концентрации промывают срезы в двух сменах 100 % эфира 5 мин.

8. Доводят через спирт до дистиллированной воды и ополаскивают в ней.

9. Срезы при комнатной температуре помещают на 2 мин в свежеприготовленный 0,1 % раствор тетразотированного диортоанизидина (соль прочного синего В) на 0,1 М фосфатном буфере Серенсена (рН 7,4).

10. Промывают в проточной воде, а затем в дистиллированной.

11. Монтируют в глицерин-желатин или проводят через серию спиртов возрастающей концентрации и ксилол, заключают в бальзам.

Результат: 

структуры с большим количеством активных сульфгидрильных групп окрашиваются в синий цвет, при меньшем количестве более рассеянных SH-групп возникает красное окрашивание.

Примечание. Для прохождения реакции имеет значение оптимальная концентрация используемой соли диазония; более высокие концентрации ведут к получению непостоянных результатов. Вместо прочного синего В можно использовать другие соли диазония: прочный красный RC, прочный синий RR, прочный черный К. ДДД-реакция допускает проведение микроспектрофотометрической количественной оценки содер­жания сульфгидрильных групп в срезах тканей. ДДД реагент можно также использовать для химического определения сульфгидрильных групп в белках.

Практически из всех аминокислот, встречающихся в тканях человека, положительную реакцию Сакагучи дает только арги­нин, гуанидин, креатинин и мочевина дают отрицательную реакцию. По существу почти все клеточные белки содержат аргинин, но реакция Сакагучи идет только в тех случаях, когда аргинин содержится в значительных концентрациях, как, например, в основных белках, в частности в гистонах, поэтому реакция Сакагучи имеет важное значение для выявления основных белков в тканях.

==========================================================================

Метод окисления надмуравьиной кислотой для выявления дисульфидина по Пирсу

1. Материал фиксируют в кальций-формоле, формалине, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды.

3. Обрабатывают 10 — 30 мин раствором надмуравьиной кислоты (к 40 мл 98 % муравьиной кислоты добавляют 4 мл 30 % свежей перекиси водорода и 0,5 мл концентрированной серной кислоты; смесь готовят за 1 ч до использования и применяют не более 24 ч).

4. Срезы промывают в дистиллированной воде.

5. Помещают на 30 — 60 мин в реактив Шиффа (особенно пригодны реактивы Шиффа, приготовленные по Де Томасси или Итакаве).

6. Промывают в проточной слегка теплой воде 10 мин.

7. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Результат: 

структуры, содержащие цистин, в зависимости от его количества окрашиваются в цвета от розового до темно-красного. Особенно интенсивно окрашиваются кератинсодержащие структуры. Четкую реакцию дают нейромедиаторы, содержащие дисульфидные группы, а также базофильные клетки передней доли гипофиза.

Вариант:

После окисления надмуравьиной кислотой срезы окрашивают 10—15 мин 0,0005 М метиленовым синим (молекулярная масса 319,8) в 0,1 М веронал-ацетатном или глициновом буфере (рН 2,6 — 2,8) вместо реактива Шиффа, затем промывают дистиллированной водой и накрывают по­кровным стеклом для непосредственного микроскопирования или быстро обезвоживают в спиртах и т.д.

Блокирование и превращение реакционноспособных групп в белках

Реакции блокирования и превращения реакционноспособных групп аминокислот могут служить не только контролем на специфичность гистохимической методики, но и, как это видно при рассмотрении некоторых реакций гистохимии белков, быть одновременно решающим этапом при гистохимическом выявлении реактивных групп (например, окислительное дезаминирование, реакция с динитрофторбензолом). В табл. 1 представлены наиболее часто используемые реакции подобного рода.