МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА МЫШИ

Дж. Браун и Н. Р. Лит

1. Основные принципы получения антителообразующих клеточных линий

В 50-е гг. Вернет, Ерне, Ледерберг и Толмейдж постулировали, что каждый В-лимфоцит запрограммирован на синтез антител одной определенной специфичности, относящихся к тому же идиотипу, что и молекулы, экспрессированные на поверхности данного лимфоцита в качестве антигенных рецепторов. В настоящее время это положение убедительно доказано. Если животное иммунизируют каким-либо антигеном, то начинается клональная экспансия и дифференцировка тех В-лимфоцитов, которые распознают этот антиген. В результате образуются плазматические клетки, которые продуцируют антитела. Если бы индивидуальные антиген-реактивные клетки лимфоидной ткани иммунизированного животного удалось длительное время поддерживать в культуре, то надосадочная жидкость содержала бы однородные молекулы антител (моноклональные антитела), которые были бы способны распознавать только один или несколько близкородственных антигенов. 

К сожалению, потомство индивидуального реактивного лимфоцита не удается длительное время выращивать в культуре для получения больших количеств моноклональных антител (МКА). Впервые эта проблема была решена Келером и Мильштейном в 1975 г. [1]. Исследователям удалось трансформировать антителообразующие лимфоциты путем слияния их с клетками иммортализованной клеточной линии с последующим клонированием индивидуальных гибридных клеток. Таким образом были получены линии гибридных клеток (гибридомы), каждая из которых продуцировала молекулы антител одного и того же идиотипа.

Уже давно было известно, что различные типы клеток разных видов животных могут сливаться между собой с образованием гибридных клеток. Однако высокодифференцированные признаки партнеров сохраняются в том случае, если они представляют собой клетки сходных линий, находящиеся приблизительно на одной и той же стадии дифференцировки [2]. Клеточная линия, секретирующая антитела, образуется путем слияния антителообразующей клетки лимфоидной ткани иммунизированного животного и клетки плазмацитомы, находящейся на сходной стадии дифференцировки. Полученная в результате гибридом а наследует от одной родительской клет¬ки способность к секреции антител определенного идиотипа и от другой (клетки плазмацитомы)—способность к неограниченному росту in vitro. Наиболее успешно получают гибридомы мышей и крыс, менее успешно — гибридомы человека. Технология гибридизации клеток других видов животных разработана недостаточно. Альтернативным подходом для получения антителообразующих клеточных линий человека служит использование вируса Эпштейна — Барр (ВЭБ) для трансформации определенной популяции В-клеток иммунизированного индивидуума [3]. Клетки, продуцирующие большое количество антител, затем подвергают селекции и клонированию (см. гл. 4). В данной главе будет рассматриваться только технология получения гибридом. Известны многочисленные литературные обзоры, посвященные этой теме, например [2, 4—6].

2. Оборудование и материалы

Необходимо хорошее оборудование для работы с культурами, в том числе С02-термостат (содержание С02 в воздухе — 5%)- Желательно иметь ламинарный бокс для осуществления манипуляций в стерильных условиях. Следует отметить, что знание основ асептики и некоторый опыт в работе с клеточными культурами важны для успешного проведения работ. Для визуального наблюдения за культурами необходим инвертированный микроскоп (например, Olympus СК; модель снабжена широкой ровной подставкой, объективом ХЮ и бинокулярной насадкой WF 15Х). Кроме контейнеров с жидким азотом для хранения плазмацитом и гибридом, для получения моноклональных антител необходимо не так уж много специального оборудования. Позднее будут рассмотрены возможные варианты процедур скрининга, которые, 'по-видимому, следует усовершенствовать и более широко внедрять в практику. Для иммунизации необходимо иметь инбредные линии мышей (обычно BALB/c) или крыс (Lou). Если предполагается выращивать гибридомы в виде асцитных опухолей, то понадобится довольно большое количество животных.

2.1. Материалы

2.1.1. Линии плазмацитом

Используемые для получения гибридом плазмацитомные клеточные линии дефектны по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе   (ГТФРТ) и отбираются на среде, содержащей тиогуанин (2-Ю-5 М). Это означает, что клетки, дефектные по .ГТФРТ, не способны к синтезу ДНК, если их культивировать в среде с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (среда ГАТ). В результате слияния с родительскими лимфоцитами этот дефект устраняется. Таким образом, только гибридные клетки способны расти на среде ГАТ.

Линии плазмацитом обычно культивируют в стандартной неразбавленной среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина (Gibco Bio-cult, США), 10% сыворотки плода коровы (СПК), антибиотиков — пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл), а также тиогуанина (20 мМ). В продажу поступает коммерческий препарат (Gibco Bio-cult, США) исходного стократного (100Х) раствора пенициллина и стрептомицина в нужной концентрации. Среду дополняют тиогуанином для удаления ревертантных клеток, содержащих «нормальный» уровень ГГФРТ, которые, подобно гибридным, выживают в среде ГАТ.

1.Готовят ЮОХ раствор тиогуанина (2 мМ) следующим образом. 

Растворяют 33,44 мг безводного тиогуанина в 100 мл дистиллированной воды. 

Добавляют 1 М NaOH, если необходимо, для растворения тиогуанина и доводят рН до 9,5 уксусной кислотой. 

Фильтруют раствор через мембраны Millipore-(размер пор 0,2мкм), 

разливают на аликвоты и хранят при-20 °С.

2.Для приготовления поддерживающей среды для плазмацитомы смешивают следующие растворы:

500 мл среды RPMI-1640, содержащей L-глутамин; 

50 мл инактивированной нагреванием СПК (конечная концентрация—9%);

5,5 мл исходного раствора пенициллин/стрептомицин; 

5,5 мл стандартного исходного раствора тиогуанина.

ГАТ-чувствительная плазмацитома, полученная от мышей линии BALB/c, P3-NSI/Ag4-l (как правило, обозначаемая NSI), представляет собой вариант линии МОРС21, не секретирующий иммуноглобулинов [4]. Она хорошо растет in vitro на среде RPMI-1640 с добавлением 10% СПК, а также при внутрибрюшинном введении мышам BALB/c. Эта плазмацитома синтезирует, но не секретирует легкие цепи иммуноглобулинов. ГАТ-чувствительная плазмацитома X63/Ag8.653, полученная от мышей линии BALB/c, представляет собой вариант линии X63/Ag8; она не синтезирует ни тяжелых, ни легких цепей иммуноглобулинов [4]. Клетки обеих линий хорошо сливаются, но гибридомы, образованные с помощью NSI, растут несколько лучше.

2.1.2. Реагенты, используемые для слияния

В ранних работах таким реагентом обычно служил инактивированный ультрафиолетом вирус Сендай. К настоящему времени его заменил полиэтиленгликоль (ПЭГ), который обычно применяют в виде 50%-ного (вес на объем) раствора. 50%-ный раствор ПЭГа целесообразно готовить на воде, а не на обычной культуральной среде, поскольку в этой концентрации он гипертоничен. ПЭГ — это слабая кислота; для ее нейтрализации достаточно 1 мМ NaOH.

1.Отвешивают 8 г ПЭГа 1500 в универсальный стеклянный флакон.

2.Готовят 1 мМ раствор NaOH в дистиллированной воде и добавляют к нему одну каплю фенолового красного (изменение окраски от красной до пурпурной). Добавляют 8 мл этого раствора к ПЭГ и оставляют при 37 °С для растворения.

3.Стерилизуют автоклавированием в негерметично закрытом сосуде и проверяют уровень жидкости по маркировке на флаконе. Если уровень раствора, ниже отметки, доводят объем до первоначального с помощью стерильного раствора 1 мМ NaOH.

4.Остужают, разливают на аликвоты по 3 мл в стерильные ампулы и хранят при 4С.

2.1.3. Среда ГАТ

Эту среду обычно используют для селекции и культивирования гибридных клеток; она состоит из неразбавленной стандартной среды RPMI-1640, в которую добавлен L-глутамин, 20% СПК, пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), 100 мкМ гипоксантина, 16 мкМ тимидина и 0,5 мкМ метотрексата.

Готовят следующие исходные растворы.

1.Гипоксантин и тимидин. 

Готовят 100Х исходный раствор, содержащий 10 мМ гипоксантина и 1,6 мМ тимидина. 

Растворяют 408 мг гипоксантина в 10 мл дистиллированной воды при постоянном перемешивании и добавляют 1 М NaOH по каплям до растворения гипоксантина. 

Растворяют 114 мг тимидина в 100 мл дистиллированной воды. 

Смешивают оба раствора и доводят объем до 300 мл дистиллированной водой. Доводят рН до 10,0 с помощью НС1 или NaOH, стерилизуют фильтрованием через мембраны Millipore, разливают на аликвоты и хранят при —20 °С.

2.Аминоптерин (метотрексат). 

Аминоптерин (100Х исходный раствор с концентрацией 50 мкМ) готовят из ампулированного лекарственного средства метотрексата.  Ампулы содержат по 2 мл раствора с концентрацией 25 мг/мл. При извлечении препарата из ампул следует соблюдать осторожность, поскольку метотрексат токсичен. Разводят 0,9 мл раствора метотрексата в 1 л дистиллированной воды и доводят рН до 7,5 с помощью 0,01 М NaOH или 0,01 М НС1. Стерилизуют фильтрованием через мембраны Millipore, разливают на аликвоты и хранят при —20 °С.

3. 2-Меркаптоэтанол. 

2-Меркаптоэтанол в концентрации 50 мкМ может быть добавлен к среде ГАТ в качестве агента, способствующего росту гибридных клеток. Кроме того, его следует обязательно добавлять при клонировании гибридных клеток. Для приготовления среды с 2-меркаптоэтанолом к 10 мл стандартной среды RPMI-1640 добавляют 0,06 мл препарата. Стерилизуют фильтрованием, разливают на аликвоты и хранят при —20 °С.

Для приготовления полной среды ГАТ необходимо смешать следующие стандартные растворы: 

500 мл среды RPMI-1640 с L-глутамином;

100 мл инактивированной нагреванием СПК (концентрация СПК приблизительно 16%);

6 мл исходного раствора пенициллин/стрептомицин; 6 мл исходного раствора гипоксантин/тимидин; 6 мл стандартного раствора метотрексата;

12 капель (0,36 мл) 2-меркаптоэтанола добавляют пастеровской пипеткой, как указано выше.

2.1.4. Среда Дюльбекко

Среду Дюльбекко готовят из готового сухого концентрата (Gibco Bio-cult, США) и используют вместо среды RPMI-1640 или в комбинации с ней. Так называемые щелочные среды Дюльбекко или RPMI-1640, обычно используемые на стадии слияния, — это среды, которые предварительно защелачивают в универсальных контейнерах путем равновесного взаимодействия с атмосферным воздухом. Этого очень легко достигнуть, если за несколько дней до использования крышку на флаконе закрыть неплотно.

2.1.5. Сыворотки

Обычно используют сыворотку плода коровы (СПК), предварительно инактивированную нагреванием в водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. Различные партии СПК значительно варьируют по способности поддерживать рост культур, поэтому чрезвычайно важно выбрать хорошую партию. Самый простой и надежный способ определения качества сыворотки заключается в клонировании гибридомы методом лимитирующих разведений (см. разд. 6.4) в среде, содержащей образцы анализируемой сыворотки. Дополнительное введение в среду для инкубации лошадиной сыворотки (5%) часто оказывает положительный эффект, если СПК невысокого качества. Рекомендовано и применение сыворотки крови человека [7]. Разумеется, нельзя использовать сыворотку, содержащую антиген, к которому направлены получаемые моноклональные антитела (например, иммуноглобулин человека или других видов, с которыми наблюдаются перекрестные реакции, в том случае, когда требуется получить моноклональные антитела к иммуноглобулину).

2.1.6. Среда RPMI с буфером Hepes (H-RPMI)

Это среда RPMI-1640, которая забуферена Hepes (N-2-гидроксиэтилпиперазин-Л'/-2-этансульфоновая кислота) в концентрации 4,6 г/л вместо обычного бикарбоната натрия. В среду H-RPMI добавляют 2% СПК (H-RPMI — 2% СПК). В результате получают идеальный реагент для промывания и суспендирования клеток при работе с ними вне термостата, так как он сохраняет стабильное значение рН при атмосферных условиях. Но в качестве ростовой среды H-RPMI — 2% СПК непригодна.

3. Иммунизация мышей

Могут быть использованы животные в возрасте 3—4 мес любого пола. Используемая схема иммунизации зависит от природы иммуногена в такой же степени, как и при получении поликлональной антисыворотки. Важно установить, что у мышей, клетки которых предполагается использовать в экспериментах по слиянию, в ответ на введение данного иммуногена образуются антитела. Забор крови для контрольного исследования производят из хвостовой вены спустя неделю после заключительной иммунизации. Если в сыворотке обнаруживают антитела в адекватном титре, то за 3—4 дня до извлечения селезенки для слияния клеток производят последнее введение иммуногена. Иногда трудно интерпретировать результаты тестирования крови, поскольку сыворотка содержит сложную смесь антител. Неоднозначно, что все данные антитела были образованы секретирующими клетками селезенки, а также, что именно эти антиген-реактивные клетки будут преимущественно синтезировать Ig в ходе иммунного ответа на повторное введение антигена. Однако тестирование крови животного указывает на образование или отсутствие нужных антител.

3.1. Иммунизация антигенами клеточной поверхности (и другими корпускулярными антигенами)

Для антигенов клеточной поверхности может быть использована следующая схема иммунизации. Выбор процедуры может определяться количеством клеток, доступных для иммунизации.

1.Иногда достаточно двух внутрибрюшинных (в/б) инъекций 107 целых клеток в PBS, произведенных соответственно за 4 нед и за 3—4 дня до процедуры гибридизации.

2.Авторы предпочитают соблюдать следующую схему: за 3—4 нед до гибридизации внутрибрюшинно вводят первичную дозу (107 целых клеток), а затем проводят последующие иммунизации за 7 и за 3 дня до слияния. За неделю до второго введения иммуногена кровь мышей тестируют.

3.Альтернативный подход заключается в иммунизации мышей внутрибрюшинно суспензией клеток в PBS (разовая доза составляет 107 клеток) на 0, 14 и 21-й день. Спустя семь дней тестируют кровь, и животным с высоким уровнем антител внутривенно (в/в) вводят по 107 клеток за три дня до слияния.

4.В том случае, когда мышей иммунизируют клетками человека, наблюдается выраженный ответ на видоспецифические антигены. Для того чтобы направить иммунный ответ мышей на антигены, селективно экспрессированные на поверхности определенных клеток, может быть использован метод «маскировки» антителами. Например, он был успешно использован при получении моноклональных антител, специфичных к антигенам, избирательно экспрессированным на клетках миелоидного ряда человека. Клетки миелоидного ряда, которыми иммунизировали мышей для экспериментов по гибридизации, были нагружены мышиными антителами к лейкоцитам периферической крови человека [8]. Смысл данного подхода заключается в том, что, нагружая клетки, удается «замаскировать» иммуногенные поверхностные белки, экспрессируемые клетками человека.

Введенный в/б или в/в антиген достигает слезенки, и с этого момента данный орган обычно становится источником антитело-продуцирующих клеток, которые используются в экспериментах по слиянию. В ряде случаев непосредственно перед слиянием антиген вводится в/в, что может вызвать анафилактический шок. Если же необходимость в проведении в/в инъекции сохраняется, то для избежания возможного развития шока рекомендуется провести за несколько часов до этой инъекции в/б инъекцию (например, в/б утром и в/в в полдень) .

3.2. Иммунизация растворимыми антигенами

Для растворимых антигенов известны разнообразные схемы иммунизации. Например, первую инъекцию 100 мкг антигена, эмульгированного в полном или неполном адъюванте Фрейнда, осуществляют подкожно (в 0,1 мл), а последующие инъекции (по 100 мкг в PBS объемом 0,5 мл) проводят в/б с интервалом в месяц. Отбирают пробу крови, чтобы убедиться в наличии адекватного титра антител в сыворотке, а затем осуществляют последние инъекции антигена (в/б утром и в/в днем), за 3—4 дня до гибридизации.

Некоторые исследователи предпочитают избегать применения адъюванта Фрейнда. Действительно, он может стимулировать развитие гранулом, клетки которых повышают фоновый рост в культурах после гибридизации. Предпочтительнее использовать адсорбированный на квасцах антиген в смеси с убитыми клетками Bordetella pertussis в качестве адъюванта [9]. Другой способ, который был успешно применен в случае иммуноглобулинов, заключается в связывании антигена с частичками пластика [10] с последующим осуществлением иммунизации в/б, без адъюванта. Относительно небольшие пептиды иногда необходимо конъюгировать с белком-носителем, но они могут приобрести иммуногенность при введении в полный адъювант Фрейнда.

4. Методика гибридизации

Известны различные модификации оригинального метода Келера и Милыптейна [1]. Популярны методики Галфре [11] и Кеннета [5], однако практически каждый научный центр стремится развивать свою собственную методику, которой отдает предпочтение.

Перед тем как рассмотреть некоторые наиболее существенные модификации, мы остановимся на двух основных методиках гибридизации, которые используются одинаково успешно. Они иллюстрируют возможность широких вариаций при осуществлении различных стадий метода без снижения эффективности гибридизации. В частности, в первом случае клетки после слияния культивируют в 96-луночной панели для микротитрования. Во втором случае гибридомы выращивают в 24-луноч-»ых панелях для культуры тканей (объем лунки 2 мл). В данном случае выбор панели может быть обусловлен как удобством манипуляций при работе с клетками, так и определенными навыками в работе с культурой ткани и имеющимся в распоряжении оснащением.

Успех экспериментов по гибридизации будет зависеть от тщательного и адекватного манипулирования с клетками во время процесса слияния (см. разд. 4.3). Если первая попытка оказалась неудачной, то необходимо повторить эксперимент, следуя выбранной вами вначале методике. Опыт, полученный в результате первой попытки, гарантирует, что при второй вы проведете эксперимент более тщательно. Если же у вас по-прежнему возникают проблемы при культивировании гибридных клеток, то следует прибегнуть ко второй методике. Таким образом можно избежать ошибки, о которой вы не подозреваете (см. разд. 4.3).

4.1. Методика А

Удобно и целесообразно ставить параллельно два эксперимента по слиянию, используя селезенки от двух мышей. Перед процедурой слияния следует подготовить следующие материалы:

1.Отбирают образец плазмацитомной линии путем ресус-пендирования клеток, растущих в среде с тиогуанином. В случае линии NSI при встряхивании флакона клетки ресуспенди-руются плохо, поэтому их переводят в суспензию, обмывая монослой средой, вытекающей из пастеровской пипетки. Из полученной суспензии отбирают 4 капли, добавляют 1 каплю 1%-ного трипанового синего и подсчитывают количество живых клеток. Для каждого отдельного эксперимента по слиянию центрифугируют по 107 жизнеспособных клеток в круглодонных пробирках (из пирекса) на 30 мл с крышками при 500g течение 5 мин. Удаляют супернатант, ресуспендируют клетки в 20 мл среды H-RPMI — 2% СПК и оставляют при4°С.

2.Четыре шприца на 10 мл (каждый заполнен 10 мл H-RPMI — 2% СПК и снабжен иглой № 26). Оставляют в закрытом стерильном боксе в ламинарном шкафу.

3.Два шприца на 1 мл (каждый заполнен 0,7 мл 50%-ного раствора ПЭГ в 1 мМ NaOH). Оставляют в термостате на 37 °С.

4.Два универсальных контейнера, содержащие по 10 мл среды RPMI-1640. 

Оставляют при 4 °С.

5.Два универсальных контейнера, содержащие по 20 мл среды RPMI-1640. 

Оставляют при 37 °С. 

6.Щелочная среда RPMI-1640. Небольшое количество оставляют в закрытом универсальном контейнере в ламинарном шкафу.

7.Два флакона, содержащие по 30 мл полной среды ГАТ. 

Оставляют в термостате на 37 °С.

8.На столе: секундомер, 70%-ный этанол, стерильные инструменты, водяная баня на 37 °С, шприцы на 1 мл, иглы для шприца (№ 15), две чашки Петри, содержащие по 1 мл H-RPMI —2% СПК.

9.В ламинарном боксе: две чашки Петри, пастеровские пипетки, пипетки.

10. 96-луночные панели для микротитрования. Их можно использовать без предварительной подготовки. Однако мы предпочитаем добавлять 1 каплю смеси равных объемов лошадиной сыворотки и среды ГАТ в каждую лунку, а затем оставляем панели на время процедуры гибридизации при 4 °С.

4.1.1. Процедура гибридизации А (основанная на парном слиянии)

На этой стадии кровь мышей предварительно уже была тестирована и анализ сыворотки показал, что в ней содержится достаточное количество антител к данному иммуногену.

1.Забивают мышь путем дислокации шейных позвонков и обмывают тушку 70%-ным этанолом. Удаляют избыток спирта с помощью фильтровальной бумаги. Помещают мышь на анатомический столик, предварительно обработанный 70%-ным этанолом, и стерильными инструментами производят продольный разрез брюшка, чтобы обнажить селезенку. Извлекают селезенку с помощью стерильных ножниц и пинцета, помещают ее в небольшое количество среды в маленькой, стерильной чашке Петри и переносят в ламинарный бокс.

2.Обмыв селезенку средой, переносят ее в новую чашку Петри и приступают к вымыванию лимфоидных клеток, используя шприцы на 10 мл с иглой № 26 (в каждый шприц набирают по 10 мл H-RPMI —2% СПК). Вымывание производят следующим образом. При помощи одного шприца удерживают селезенку, затем производят вымывание, последовательно прокалывая небольшие участки селезенки и выпуская жидкость сначала из одного шприца, затем из другого.

3. Удаляют капсулу и строму селезенки из чашки Петри и переносят суспензию клеток пастеровской пипеткой в пробирку на 30 мл, оставляя маленькие кусочки ткани селезенки, которые могли осесть на дне чашки. Пробирку оставляют в штативе в ламинарном боксе. Повторяют процедуру с другой селезенкой.

4. Помещают по 4 капли каждой суспензии спленоцитов в лунки панели для микротитрования (нестерильной). Помещают предварительно подписанные пробирки с суспензией спленоцитов и пробирки с клетками плазмацитомы (извлеченные из холодильника на 4 °С) в дентрифугу на 5 мин при 500 g. Тем временем добавляют по 1 капле 1%-ного трипанового синего в каждую лунку с суспензией клеток в панели для микротитрования, перемешивают пастеровской Пипеткой и помещают каплю в камеру для подсчета клеток. Определяют количество жизнеспособных лимфоцитов и лимфобластов. Общее .количество полученных спленоцитов обычно составляет 0,6— 1,2-10s, из них жизнеспособных — около 90%. В большинстве экспериментов 108 клеток селезенки сливают с 107 клетками плазмацитомы.

5. По окончании центрифугирования вынимают пробирки из центрифуги и осторожно сливают супернатант в стакан для отходов в стерильном ламинарном боксе. Слегка встряхивают пробирки, чтобы диспергировать осадок. Добавляют по 10 мл холодной среды RPMI-1640 в каждую пробирку с клетками селезенки и переносят содержимое каждой пробирки в одну из пробирок, содержащих клетки плазмацитомы. Осаждают клетки центрифугированием при 400 g в течение 7 мин, а в это время переносят чистую водяную баню на 37 °С в стерильный ламинарный бокс. Полностью удаляют супернатант пастеровской пипеткой. К осадку клеток добавляют 5 капель щелочной среды RPMI-1640. Пробирки слегка встряхивают, чтобы диспергировать клетки.

6. Процедура гибридизации занимает 35 мин. Устанавливают секундомер на 35 мин. Последовательность операций описана в табл. 3.1. Все этапы, описанные для пробирки № 1, повторяют с пробиркой № 2. (Начало работы приходится на момент времени 29.00 в таблице для пробирки № 1). Когда закончено центрифугирование пробирки № 1, ее переносят в ламинарный бокс и центрифугируют приборку № 2, которая к этому времени должна быть готова.

7. Удаляют супернатант из пробирки № 1 и добавляют к осадку 30 мл теплой среды ГАТ. Закрывают пробирку и переворачивают ее, чтобы ресуспендировать и диспергировать клеточный осадок. Подготавливают и подписывают по 6 панелей для микротитрования на каждую из двух процедур слияния. Используя пастеровскую пипетку, распределяют клетки (по одной капле на лунку) во все 96 лунок каждой из 6 панелей. Когда все панели заполнены, их ставят друг на друга и переносят в С02-термостат с увлажненным воздухом. Повторяют те же процедуры с клетками, которые используются для второго слияния.

На ранних стадиях культивирования, когда общий объем содержимого в лунке составляет всего 0,07 мл, чрезвычайно важно, чтобы атмосфера термостата была насыщена влагой и поддерживался достаточный уровень СО2; в противном случае может произойти испарение. На пятый день в каждую лунку добавляют по 0,15 мл среды ГАТ с помощью многоканальной пипетки, снабженной стерильными полиэтиленовыми наконечниками. Среду наливают в стерильную емкость подходящего размера.

Когда среда в большинстве лунок станет желтой (что обусловлено ростом клеток, сопровождающимся выделением кислых продуктов метаболизма), то ее полностью заменяют, с тем чтобы удалить «фоновые» антитела, образуемые еще сохранившими жизнеспособность иммуноглобулин-секретирующими клетками селезенки. Это осуществляют следующим образом. Носик пастеровской пипетки вытягивают в очень, тонкий капилляр, а затем кончик длиной около трех сантиметров загибают под прямым углом. Вытянутые пипетки стерилизуют автоклавированием   в алюминиевых контейнерах.

На дно контейнера помещают немного хлопковой ваты, чтобы избежать повреждения кончиков пипеток. Пастеровские пипетки присоединяют к насосу, полностью удаляют жидкость из лунок и вносят в них по 0,2 мл среды ГАТ (иногда вместе <с 5% лошадиной сыворотки), используя для этой цели многоканальную пипетку. Таким образом обрабатывают все панели л снова помещают их в термостат. Через 2 дня среда во многих лунках, как правило, опять становится желтой. Как раз в это время необходимо проверить супернатанты на содержание антител. Можно тестировать отдельные лунки по мере того, как среда в них желтеет, или подождать, пока это не произойдет в большинстве лунок, и тогда протестировать сразу: все супернатанты. Первая процедура, которой следует отдать предпочтение, если используется трудоемкая система анализа, заключается в удалении почти всего супернатанта с помощью пастеровской пипетки и переносе его в пронумерованные панели для тестирования. Прежде чем приступить к тестированию среды в следующей лунке, предыдущую следует заполнить свежей средой. Чрезвычайно важно избегать переноса клеток из одной лунки в другую. Пастеровскую пипетку можно простерилизовать с помощью кипящей воды, набираемой и вновь выпускаемой из пипетки, и охладить, набирая холодную среду. Лишь затем эту пипетку используют для работы со следующей лункой. Если применяют простую систему анализа (например, реакцию пассивной гемагглютинации), то проще и информативнее отбирать пробы со всей панели, используя многоканальную пипетку. Технология скрининга рассматривается в разд. 5.

Панели следует ежедневно просматривать под инвертиро-ванным микроскопом. В течение первых двух дней, как правило, можно наблюдать лишь отдельные клетки (по размеру и морфологии сходные с плазмацитомными) на фоне сгруппи-рованных клеток селезенки. На четвертый день, если гибридизация прошла успешно, в некоторых лунках должны появиться небольшие колонии ги!бридомы. К пятому дню, когда в лунки дополнительно добавляют среду, в некоторых из них должны выявляться большие колонии гибридом, которые на 7-й день должны быть заметны уже в 20—100% от общего числа лунок. К этому времени выжившие клетки селезенки образуют скопления, которые могут интенсивно расти и угро¬жать выживанию медленно растущих гибридом. Успешная процедура слияния требует не только хороших условий для слияния клеток и обогащенной среды, стимулирующей рост, но и подавления роста сохранивших жизнеспособность клеток селезенки. К последним могут относиться макрофаги, фибропласты, предшественники тучных клеток 12] и лимфоциты, которые образуют агломераты. Жизнеспособность этих клеток зависит от состояния их активности в селезенке к моменту забоя животного (мыши). Многие адъюванты повышают эту активность. Одна из причин добавления к клеткам после слияния холодной, щелочной лошадиной сыворотки заключает¬ся в том, что она, возможно, угнетает рост «фоновых» клеток, одновременно стимулируя рост клеток гибридомы. Конкурен¬ция в росте важна только на очень ранних стадиях. .Как толь¬ко гибридома стабилизировалась, ее способность к размножению опережает таковую всех других типов клеток.

4.2. Методика Б

В данном случае также удобно провести два слияния в один день, используя селезенки от двух мышей. Обычно мы ставим эксперименты по слиянию последовательно — утром и после полудня.

Непосредственно перед слиянием подготавливают следую-щие материалы н оборудование,(в расчете на одно слияние).

1. Отбирают образец плазмацитомы, как описано в методике А, и помещают 107 жизнеспособных клеток в универсальный контейнер. Оставляют при 37 °С до приготовления суспензии селезеночных клеток.

2. Шесть флаконов, содержащих по 20 мл среды RPMI-1640. 

Помещают в водяную баню или термостат на 37 °С.

3. Четыре флакона, содержащие по 24 мл среды RPMI-4640 с 20% СПК и пенициллином/стрептомицином. Оставляют при 37 °С с плотно закрытыми крышками, чтобы избежать защелачивания среды.

4. Два шприца на 10 мл с иглами № 23 (в каждом содержится по 10 мл среды RPMl-1640). Хранят в закрытой стерильной упаковке в ламинарном боксе.

5. Один шприц на 1 мл, содержащий 0,8 мл 50%-ного ПЭГ в среде RPMI-1640. Хранят при 37 °С.

6. На столе: секундомер, 70%-ный этанол, фильтровальная бумага, пробирка для уравновешивания с 21 мл воды, водяная баня на 37 °С, стерильные инструменты, чащка Петри с 1 мл среды RPMI-1640.

7. В ламинарном боксе: пипетки, чашка Петри.

8. Две 24-луночные (объем лунки 2 мл) культуральные панели (Costar, США). Они используются без предварительной подготовки.

4.2.1. Процедура гибридизации Б (основанная на одинарном слиянии]

Готовят суспензию клеток селезенки, как описано в методике А. 

Помещают 108 жизнеспособных   клеток селезенки в  подходящий универсальный контейнер. Вынимают контейнер с клетками плазмацитомы из термостата на 37 СС. Дважды отмывают клетки селезенки и клетки плазмацитомы в отдельных контейнерах, используя предварительно нагретую до 37 °С среду RPMI-1640. Центрифугируют при 200 g в течение 10 Мин и слегка встряхивают контейнеры, чтобы диспергировать осадок клеток, образовавшийся во время отмывания. После двух отмываний ресуспендируют клетки каждого типа в 10 мл теплой среды RPMI-1640. Вливают суспензию клеток селезенки в универсальный контейнер с клетками плазмацитомы и тщательно перемешивают клетки, осторожно переворачивая контейнер. Центрифугируют при 440 g в течение 10 мин. С помощью пастеровской пипетки полностью удаляют супернатант, оставив только осадок клеток. Слегка встряхивают контейнер, чтобы диспергировать клетки, а затем осуществляют следующие процедуры.

1. Помещают контейнер в водяную баню на 37 °С, находящуюся в ламинарном боксе, или в термостат и оставляют на 5 мин для достижения указанной температуры.

2. Помещают, вынув из термостата, наполненный ,ПЭГ шприц в ламинарный бокс. Вынимают контейнер из термо¬стата на 37 °С и слегка /встряхивают для перемешивания и распределения осадка клеток по коническому дну контейнера.

3. Через 1 мин добавляют в контейнер 0,8 мл ПЭГ. Вращают контейнер в наклонном положении, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток и ПЭГ по коническому дну контейнера.

4. Оставляют контейнер на одну мицуту при 37 °С в водя¬ной бане или в обычном термостате.

5. Через 1 мин добавляют по каплям 1 мл среды RPMI-1640, нагретой до 37 °С.

6. Через 5 мин медленно добавляют 20 мл теплой среды RPMI-1640.

7. Центрифугируют клетки ,при 440 g в течение 15 мин, используя для уравновешивания пробирку с 21 мл воды.

8. Удаляют/супернатант и добавляют к осадку клеток 24 мл теплой среды RPMI-1640 с 20% СПК и антибиотиками. Закрывают контейнер крышкой, а затем, вращая его, ресуспендируют и диспергируют осадок клеток.

9. Подготавливают и надписывают две 24-луночные панели для культуры тканей. Используя градуированную пипетку или диспенсер на 1 мл, снабженный стерильным наконечником, добавляют по 0,5 мл суспензии клеток в каждую из 48 лунок.

10. Добавляют э каждую лунку по 1,5 мл теплой среды RPMI-1640 с 20% СПК и антибиотиками. Переносят панели в термостат с регулируемым составом атмосферы и увлажнением.

День проведения .эксперимента по слиянию обозначают как нулевой день — день 0. На Л, 2 и 3-й день после слияния осторожно заменяют по 1 мл среды из каждой лунки на 1 мл среды ГАТ. Важно не потревожить клетки в лунках, в частности, избежать перемещения клеток на одну сторону лунки при добавлении свежей среды. Это существенно по двум причинам. Во-первых, в результате обеспечивается возможность спокойного (без активации) роста «фоновых» клеток, что способствует росту гибридом. Во-вторых, на более поздних стадиях можно видеть, происходит ли в лунке рост одной или нескольких колоний гибридных клеток.

Кроме того, чрезвычайно важно избежать перекрестного переноса клеток из одних лунок в другие. Для удаления среды из каждой лунки мы используем диспенсер на 1 мл, снабженный новым наконечником одноразового использования. Когда в лунках происходит интенсивный рост гибридомных клеток, то смена наконечников для каждой лунки гарантирует также, что в супернатанты, взятые для анализа, не будут занесены антитела из других лунок. Добавление свежой среды ко всем лункам (по 1 мл) можно производить одним наконечником при условии, что не происходит контакта наконечника со средой в лунках. После, смены культуральной среды на 1, 2 и 3-й день после гибридизации вполне достаточно и удобно заменять 1 мл среды на 1 мл свежей среды ГАТ по понедельникам, средам и пятницам. Благодаря смене среды каждые 2—3 дня фоновые антитела, синтезированные сохранившими жизнеспособность клетками   селезенки, удаляются.

Перед сменой среды панели с клетками следует просмотреть род микроскопом. Морфология культур описана в методике А. Если клетки не повреждаются во время смены среды, то начавшие расти гибридомы должны образовать достаточно обособленные колонии. Если рост колоний наблюдается в большей части лунок, то необходимо подсчитать число индивидуальных колоний в каждой лунке. Если лунка содержит более одной колонии, то, проводя скрининг, следует, не откладывая, отбирать и клонировать линии гибридных клеток. В целом гибридомы, растущие в панелях Costar, должны быть клонированы как можно раньше, поскольку в данном случае в отличие от того, когда используют панели для микротитрования) в лунках образуется более одной колонии. Полезно руководствоваться следующим соображением: «если в 7 из лунок или менее наблюдается рост клеток, то в большинстве случаев в лунках представлен рост клонов.

Обычно между 18-м и ,25-м днями супернатанты исследуют на антительную активность. К этому времени гибридомные клетки практически образуют монослой и среда имеет выраженную желтую окраску. Это гарантирует, что супернатант содержит оптимальное количество антител для скрининга. Скрининг супернатантов из всех 48 лунок, включая и лунки, где не наблюдается роста, имеет то преимущество, что позволяет провести положительный отбор на фоне остаточных антител. Чтобы определить, возрастает или снижается продукция антител данной отдельной культурой, целесообразно проводить последовательное тестирование содержания антител в супернатантах, отбираемых через каждые 2—3 дня. Снижение уровня антител может .быть связано как с проблемой остаточного фонового роста в данной лунке, так и с повышенной ростовой активностью неоекретирующих гибридных клеток по сравнению с линией гибридомы. Трудно спасти антителосёкретирующие гибридомы из лунок, где в супернатантах выявляется прогрессивное снижение продукции антител. Кроме того, целесообразно попытаться клонировать отдельные клетки, но это не всегда приводит к желаемому результату.

4.3. Замечания к различным стадиям процедуры гибридизации

1.  Важно, чтобы .плазмацитома находилась в логарифмической фазе роста. Нельзя допускать полного использования клетками культуральной среды. За день до слияния желательно сменить среду. Если есть опасения, что ко дню слияния клетки могут перерасти, то можно приготовить два или три флакона с клетками плазмацитомы в различной концентрации. Б этом случае вы можете выбрать для слияния наиболее подходящую культуру. Жизнеспособность клеток, о которой судят по исключению красителя, должна быть высокой. Клеточные суспензии обычно готовят непосредственно перед слиянием, но клетки можно оставить на два часа в H-RPMI — 2% СПК,при 4°С.

2. Спленоциты лучше получать, вымывая их из селезенки, чем измельчая или раздавливая орган в гомогенизаторе. В первом случае получают листые однородные суспензии с высокой жизнеспособностью клеток. Клетки прекрасно сохраняют жизнеспособность в среде H-RPMI — 2% СПК на холоду. Это обеспечивает и более удобное (Последовательное приготовление двух селезенок. Иногда можно столкнуться с патологически измененной селезенкой, содержащей избыточное количество «леток гранулоцитарного или моноцитарног» ряда, что может быть причиной неудачной гибридизации.

3. Ореда RPMI-1640, используемая для промывания клеток, может быть заменена на среду Дюльбекко.

4.3.1. Замечания к процедуре А

1. Пробные тесты показали, что суспендирование клеток в щелочной среде RPMI-1640 (или среде Дюльбекко) представляет собой решающий этап для стадии слияния. По некоторым причинам слияние лучше происходит в щелочной среде и при этом благодаря кратковременности инкубации клетки не повреждаются. Распределение клеток по стенкам пробирки при ее вращении тоже повышает эффективность слияния, по-видимому, потому, что это гарантирует равномерное перемешивание и тесный контакт клеток. Не возникает необходимости в использовании бани на 37 °С в ламинарном боксе, но клетки следует держать при температуре около 37 °С.

2. Большинство авторов рекомендуют добавлять ПЭГ мед-ленно. Пробные тесты показали, что это не дает преимущества в случае методики А. Однако если, поместив ПЭГ на дно пробирки, попытаться распределить его в среде так, чтобы обеспечить контакт со всеми клетками, расположенными на стенках пробирки, то смешивание ПЭГа со средой происходит очень медленно. Тем не менее крайне важно, чтобы после слияния ПЭГ разбавляли медленно. Несколько порций среды, добавленные приблизительно с интервалом в 1 мин, создают условия, удовлетворяющие этому требованию. Быстрое же разбавление ведет к осмотическому повреждению клеток.

3. Обычно после слияния раскапывают по одной капле ресуспендированную клеточную смесь в пустые лунки и оставляют панели в тепле. Мы обнаружили, что целесообразно до внесения клеточной суспензии добавить в лунки по одной капле холодной 50%-ной лошадиной сыворотки. Это, по-видимому, подавляет рост «фоновых» клеток, в то же время не влияя на рост гибридом.

4.3.2. Замечания к процедуре Б

1.  При осуществлении этой методики не использовалась щелочная среда RPMI-1640 или Дюльбекко. Щелочные значения рН достигаются еще до стадии слияния промыванием клеток в свободной от сыворотки среде RPMI-1640, после чего клетки оставляют в очень небольшом объеме среды на 5 мин для достижения температуры 37 °С. За это время среда защелачивается.

2.  Крайне важно, чтобы после слияния разбавление ПЭГ происходило медленно. Цвет клеточного осадка после центрифугирования, следующего за процедурой слияния, служат индикатором осмотического повреждения клеток. Если осадок клеток значительно бледнее, чем исходной смеси спленоцитов и клеток плазмацитомы, то произошел некоторый лизис эритроцитов, а следовательно, и осмотическое повреждение гибридных клеток. Если клеточный осадок выглядит беловатым, то вероятность успешного слияния очень низка. В этом случае не имеет смысла вносить клеточную суспензию в лунки.

5. Селекция гибридом

Селекция гибридом, образующих специфические антитела, обычно происходит в два этапа. Сначала культуральную жид-кость анализируют на содержание антител, специфичных к данному иммуногену. Положительные супернатанты затем подвергают скринингу с использованием тест-панели антигенов, чтобы обнаружить, связываются ли выявленные антитела селективно с интересующим исследователя антигеном. Лунки с нужными гибридомами неизменно составляют только небольшой процент от общего числа лунок с растущими или антителопродуцирующими клетками. Важно идентифицировать нужные гибридомные клоны как можно скорее, в противном случае непроизводительно расходуются время и материалы для размножения большого числа бесполезных линий. Успех процедуры гибридизации для получения специфических антител в большой степени зависит от тщательного выполнения скрининга. Необходимо выявить данные антитела и отбросить ненужные клоны быстро и без сомнения.

Выбор используемой процедуры скрининга зависит от дальнейшего возможного использования моноклональных антител. Другими словами, если вы намерены получить моноклональные антитела, которые предполагаете использовать для лизиса клеток в присутствии комплемента, то и для скрининга следует использовать соответствующий тест (реакцию комплемент-зависимого лизиса). Подобно этому, если моноклональные антитела предполагается использовать в реакциях преципитации или для окрашивания заключенных в парафин препаратов тканей при иммуногистологических исследованиях, то именно эти методы и должны использоваться для скрининга гибридом. Тест, используемый для скрининга, в идеале должен удовлетворять следующим критериям:

1. Быть настолько простым, чтобы его мог успешно и уверенно проводить технический персонал лаборатории. Если используется простая тест-система, то более информативно собрать аликвоты со всей культуральной панели и, таким образом, отобрать положительные клоны на фоне контамини-рующих антител, продуцируемых выживающими клетками селезенки.

2. Тест необходимо по возможности автоматизировать для быстрого скрининга большого количества проб из лунок. Этого можно достичь, используя многоканальную пипетку (8 проб за один раз) и проводя тестирование в планшетах.

3. Чувствительность теста должна составлять менее 1-10 мкг антител в 1 мл. Учитываемые величины должны превышать фон не менее чем в 3 раза.

4. Результаты скрининга должны быть известны исследова-телю не позднее следующего дня, чтобы своевременно уделить внимание нужным клонам и предупредить перерастание клеток.

5. Важна достоверность результатов, поэтому процедура скрининга должна предусматривать постановку положительных и отрицательных контролей.

6. Если используют антитела к иммуноглобулинам мыши, меченные флуоресцеином, пероксидазой или 1251 (антиглобулиновый реагент), то следует тщательно проверить их специфичность по отношению к чистым белкам соответствующих под¬классов (IgGi, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM).

7. С учетом того что в процессе скрининга исследуют большое количество проб, рекомендуется проводить скрининг, используя недорогостоящие реагенты и оборудование.

Помните, что необходимо отбирать для анализа супернатанты из лунок с хорошим ростом гибридом: такая проба будет содержать оптимальное количество антител. Очень простой радиоиммунологический метод может быть использован для тестирования адекватных уровней антител в супернатантах и для повседневного контроля за образованием антител в лунках [13]. Особую ценность данный метод приобретает в том случае, если наблюдается рост в большом числе лунок, а скрининг супернатантов еще не дает положительных результатов. Обнаружение с помощью антиглобулиновых реагентов значительных титров антител означает, что чувствительность первичного скрининг-теста недостаточна и его необходимо усовершенствовать. Если выявляют мышиные иммуноглобулины в незначительной концентрации, то необходимо подождать, пока гибридомные клетки вырастут, а затем взять повторные пробы для скрининга. Можно сконцентрировать анализируемые супернатанты, хотя обычно в этом нет необходимости.

Суммируя вышесказанное, можно утверждать, что тесты, обычно используемые в лаборатории при исследовании поликлональных сывороток с высокими титрами антител, могут быть адаптированы для скрининга гибридом. Некоторые из них могут оказаться довольно сложными; например, цель исследователя может заключаться в получении моноклональных антител, которые определяют по торможению функции в каком-либо биологическом тесте. При использовании сложных и продолжительных тестов целесообразно уменьшить количество анализируемых проб. Для идентификации антителопродуцирующих клонов может быть использована простая процедура скрининга мышиного иммуноглобулина, а затем уже только эти пробы вместе с отрицательным контрольным супернатантом исследуют более сложным путем. При получении антител к поверхностным клеточным антигенам мы обнаружили, что примерно в половине лунок с растущими клонами образуются мышиные иммуноглобулины, а примерно половина или более содержащих антитела супернатантов реагировала положительно с клетками, использовавшимися для иммунизации.

5.1. Процедуры скрининга при получении антител к антигенам клеточной поверхности и другим корпускулярным антигенам

Существует определенная схема выявления специфического связывания антител с антигеном. Клетки-мишени могут быть живыми, зафиксированными глутаровым альдегидом, высушенными на стекле или же присутствовать в замороженных гистологических срезах. Тест неизбежно является непрямым, и реагентом для второй стадии могут служить антимышиные иммуноглобулины овцы, козы или кролика, меченные флуоресцеином, ферментом или радиоактивным иодом. Обычно пробу (одну каплю) супернатанта добавляют к 0,5-106 клеток-мишеней в небольшом объеме в маленькой пластиковой пробирке или в лунке панели. После 30—60 мин инкубации при 4°С суспензию разбавляют, клетки осаждают центрифугированием, отмывают один раз и инкубируют в течение 30 мин при 4°С с соответствующими разведениями поливалентного антимышино-го иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцеином. Клетки вновь отмывают и регистрируют флуоресценцию непосредственно под флуоресцентным микроскопом или с помощью проточного цитофлуориметра системы FACS [14].

5.2.  Процедуры скрининга при получении антител к растворимым антигенам

Основные альтернативные тесты — это ELISA, РИА или реакция гемагглютинации. В первых двух случаях в лунках пластиковой панели для микротитрования адсорбируют антиген (1 ч) и затем отмывают остаток несвязавшегося антигена. Далее в каждую лунку вносят по одной капле исследуемого супернатанта. Инкубацию продолжают в течение 30 мин или ночи, после чего отмывают избыток антител и добавляют антиглобулиновый реагент к иммуноглобулинам мыши, конъюгированный с ферментом или радиоактивным иодом. Инкубацию продолжают в течение часа, затем вновь осуществляют процедуру отмывания и в зависимости от выбранного теста либо выявляют ферментативную активность (ELISA), либо измеряют уровень радиоактивности в лунках (РИА). 

В реакции пассивной гемагглютинации эритроциты нагружают антигеном с помощью хлорного хрома. Такие эритроциты хранят в стерильных условиях до употребления [15]. Реакция, заключается в следующем. Добавляют одну каплю супернатанта к одной капле 0,5%-ной суспензии нагруженных антигеном эритроцитов барана. Оставляют в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем оценивают результаты.

Если следуют процедуре гибридизации А и гибридомные клетки растут в лунках панели для микротитрования, то забор образцов для тестирования одновременно со всех панелей можно осуществлять с помощью многоканальной пипетки. Отобранные пробы переносят непосредственно в панель для микротитрования с круглодонными лунками. Когда все панели с пробами полностью укомплектованы, в каждую лунку добавляют по одной капле 0,5%-ной суспензии нагруженных антигеном эритроцитов барана. Конкурирующий агент может быть добавлен в буфер для разведения с целью проверки специфичности моноклональных антител. Например, если нужно отобрать моноклональные антитела к IgG2 человека, то используют эритроциты барана, нагруженные IgG2, a IgGi добавляют к буферу для разведения. В этом случае только те МКА, которые специфически распознают IgG2, будут агглютинировать нагруженные антигеном эритроциты барана, а МКА, которые связываются и с IGg2, и с IgGi, в основном взаимодействуют с избытком IgGi в буфере для разведения. Нужные клоны выращивают в культуре, как описано в разд. 6.

6. Клонирование линий гибридомных клеток

Моноклональность антител обеспечивается клонированием гибридом. Осуществляют ли клонирование непосредственно после слияния или же на более поздней стадии, в некоторой степени зависит от того, выращивались ли первичные гибридомные культуры в лунках панели для микротитрования (процедура гибридизации А) или в объеме 2 мл в лунках 24-х луночной, панели для культуры тканей (процедура гибридизации Б).

6.1. Процедура гибридизации А

Если клетки после слияния рассевают в лунки панели для микротитрования, то гибридомы, продуцирующие антитела нужной специфичности, затем пересаживают в 24 луночные панели для культуры тканей с объемом лунок 2 мл. Далее при образовании монослоя и окрашивания среды в желтый цвет, супернатант можно повторно тестировать, используя определенный набор антигенов. Если результаты тестирования удовлетворительные, то гибридому наращивают в нескольких лунках, затем в универсальных контейнерах и далее во флаконах постепенно возрастающего объема. К этому времени обычно уже происходит самопроизвольное клонирование клеток. Тот клон, который отличается наилучшим ростом (предполагаемый источник антител), постепенно получает преимущество над всеми другими в культуре.

Клонирование лучше всего проводить или на ранней стадии, чтобы не допустить вытеснения медленно растущего клона клетками быстрорастущих соседних клонов, или на конечной стадии, когда получена стабильная линия антителообразующих клеток. В последнем случае клонирование, как правило, лишь формально подтверждает моноклональность. Если до стадии продукции антител клонирования не проводили, то его необходимо осуществить позднее, в том числе и с уже клонированными линиями. Цель такого подхода-удаление непродуцирующих антитела клонов, которые иногда образуются после длительного культивирования. Если данные клоны не отделить в процессе последующего клонирования, то они могут постепенно вытеснить другие антителообразующие клоны. Некоторые линии чрезвычайно стабильны и не требуют повторного клонирования. У других гибридомных линий изменяются ростовые характеристики и антителообразующая активность. В этом случае иногда целесообразно повторное клонирование, но некоторым линиям свойственна нестабильность. Поэтому сразу после клонирования линии клеток следует немедленно заморозить (по меньшей мере 10 ампул) в жидком азоте. Ими можно будет воспользоваться, если клонированная линия окажется нестабильной при дальнейшем культивировании.

Чем эффективнее гибридизация, тем больше вероятность, что в каждой лунке вырастет более одного клона и что два клона со сходными темпами роста будут сосуществовать в одной лунке. Наличие двух и более клонов можно выявить по обнаружению в супернатанте антител более чем одной специфичности и более чем одного класса и подкласса, а также с помощью изоэлектрофокусирования (сложный спектр анализируемых антител). При получении соответствующего результата необходимо безотлагательное клонирование.

6.2. Процедура гибридизации Б

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридому продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее снижение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки. В таком случае важно отобрать антителообразующие гибридные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный, на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клонирование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью» лимитирующих разведений.

6.3. Клонирование клеток в полужидком агаре

Для этой процедуры клонирования необходимы следующие материалы:

1. Клетки гибридомы (3-105 клеток в 1 мл полной среды ГАТ).

2. Среда ГАТ, содержащая 50 мкМ 2-меркаптоэтанола. Дер-жат в водяной бане на 44 °С.

3. 3%-ный и 5%-ный растворы бактоагара, приготовленные на 0,9%-ном растворе NaCl. Агар автоклавируют небольшими порциями.

4. Чашки Петри диаметром 5 см для работ с клеточными культурами. Процедура клонирования описана в табл. 3.2.

Таблица 3.2. Процедура клонирования клеток в полужидком агаре

1.  Расплавленный при 100 °С в сосуде с кипящей водой агар помещают в водяную баню на 44-45 °С. При обращении с горячим агаром соблюдают осторожность.

2.  Разбавляют 5%-ный агар средой ГАТ до конечной концентрации 0,5% (1 : 10), хорошо перемешивают и помещают в водяную баню на 44 °С. Удобно одновременно готовить раствор агара на три чашки Петри (1,5 мл рас¬твора агара +13,5 мл среды).

3.  Пипеткой наслаивают на дно 9 чашек Петри (диаметр 5 см) по Ъ мл 0,5%-ного агара. 

Дают агару застыть.

4. Разбавляя 3%-ный агар, готовят 9 аликвот по 5 мл 0,3%-ного раствора агара в среде ГАТ и держат их в водяной бане на 44 °С.

5.  Одну или две капли суспензии гибридомных клеток тщательно смешивают с аликвотами 0,3%-ного агара, хорошо перемешивают и распределяет ровным слоем по поверхности 0,5%-ного агара. Для каждой дозы гибридных клеток готовят по три чашки.

6. Складывают чашки в чистый пластиковый сандвич-бокс, р. который помещены чашки Петри, наполненные стерильной дистиллированной водой. Это обеспечивает влажную атмосферу в боксе. Переносят бокс с негерметично закрытой крышкой в С02-термостат с увлажнителем. Дают возможность воздуху в боксе прийти в равновесное состояние с атмосферой термостата, содержащей 5% С02, закрывают крышку бокса и оставляют на 10—14 дней.

7. На 10-14-й день с помощью пастеровских пипеток собирают колонии и переносят их в лунки панели для микротитрования.

8.  После образования монослоя тестируют супернатанты на содержание антител. Одновременно удаляют всю среду и заменяют ее свежей средой ГАТ.

9. Отобранные положительные клоны наращивают сначала в панелях для микротитрования, затем в лунках панели для культуры тканей объемом 2 мл и, наконец, в небольших флаконах порциями в стеклянных универсальных контейнерах и хранят при 4 °С;

10.  Замораживают для хранения в жидком азоте по меньшей мере 10 ампул с образцами клеток клонированной линии.

6.4. Клонирование клеток методом лимитирующих разведений

Если гибридомные клетки выращивали в панелях для кульуры тканей с объемом лунок 2 мл (процедура гибридизации Б), а клонирование проводили в мягком агаре, как описано выше, то в некоторых случаях необходимо было проанализировать большое число колоний, прежде чем удалось обнаружить антителообразующую колонию. По этой причине клонирование проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для микротитрования с помощью последовательных разведений клеточной взвеси. Преимущество такого подхода заключается в том, что образование антител единичными колониями, растущими в лунках, в которые предварительно засеяли по одной клетке, может быть просто проконтролировано. Метод лимитирующих разведений легко воспроизводится. Он позволяет избежать проблем, связанных с технологией приготовления агара, когда эффективность клонирования часто зависит от качества агара и его консистенции.

Метод лимитирующих разведений -это трехстадийная процедура. Поэтому для получения клонированных клеточных линий с его помощью требуется больше времени.

6.4.1.   Первая стадия метода лимитирующих разведений

В процессе клонирования необходимо отобрать наиболее жизнеспособные, хорошо растущие гибридомы с высоким уровнем продукции антител. Цель первой стадии-отделить субкультуру, характеризующуюся более высоким уровнем продукции антител, от первоначальной культуры, которую выращивают в лунках объемом 2 мл.

1. Помещают клетки гибридомы, взятые из первоначальной культуры, в панель для микротитрования из расчета 100 клеток на лунку в 200 мкл среды ГАТ (5-102 клеток в 1 мл).

Используют 48 центральных лунок панели (6 рядов по 8 лу¬нок каждый). Лунки, расположенные по периферии панели, заполняют средой RPMI-1640, содержащей антибиотики (для предотвращения испарения влаги и концентрирования среды ГАТ в лунках, содержащих клетки).

2. Инкубируют панель в С02-термостате с увлажненным воздухом.

3. Спустя приблизительно 7 дней, когда клетки в лунках практически образуют монослой, исследуют супернатанты на содержание антител. Целесообразно протестировать неразбавленный супернатант и, если возможно, одно или два разведения (1 :4 и 1 : 16). Из тех лунок, где антитела содержатся в наиболее высоких титрах, отбирают для клонирования единичные, наиболее жизнеспособные и хорошо растущие клетки. Выбирают две лунки, из которых клетки рассевают на второй стадии метода лимитирующих разведений.

6.4.2.   Вторая стадия метода лимитирующих разведений

Цель этой стадии — отобрать линии гибридных клеток, образовавшиеся из одной клетки, и осуществить рассев гибридом на фидерный слой клеток селезенки.

1. Готовят суспензию спленоцитов (как описано для процедур гибридизации) за день до постановки   эксперимента по клонированию и ресуспендируют клетки (106 клеток в 1 мл среды ГАТ, содержащей 100 мкМ 2-меркаптоэтанола).

2. Оставляют клетки селезенки в универсальном контейнере на ночь при комнатной температуре в ламинарном боксе для стерильных работ. Преимущество этой процедуры заключается в том, что она позволяет экспериментатору на следующий день проверить спленоциты под микроскопом и убедиться, что они не загрязнены. Вероятно, это подавляет и рост фоновых клеток селезенки в лунках, где проводят клонирование.

3. Подготавливают две панели для микротитрования следующим образом. Опять используют только 48 центральных лунок панели (6 рядов по 8 лунок), а расположенные по периферии заполняют средой RPMI-1640, содержащей антибиотики. В 8 лунок первого ряда добавляют по 100 мкл полной среды ГАТ. В 8 лунок каждого ряда (со 2-го по 6-й) добавляют по 100 мкл суспензии клеток селезенки в концентрации 105 клеток на лунку.

4. Помещают обе панели в С02-термостат на время, необходимое для приготовления последовательных разведений гибридных клеток. Очень важно приготовить разведения и поместить их в панели как можно скорее. Если клетки оставить на длительное время в суспензии (в которой число клеток невелико), то они потеряют свою жизнеспособность. Две панели с повторными разведениями готовят, используя клетки двух выбранных лунок первой панели. Серии разведений двух популяций клеток гибридомы готовят последовательно и отбирают клетки из лунок первой панели по мере необходимости.

5. Готовят суспензии клеток в полной среде ГАТ: 1 мл суспензии с концентрацией 103 клеток в 1 мл, 1 мл суспензии с концентрацией 102 клеток в 1 мл, 1 мл суспензии с концентрацией 50 клеток в 1 мл, 2 мл суспензии с концентрацией 10 клеток в 1 мл и 1 мл суспензии с концентрацией 5 клеток в 1 мл. Следует заметить, что готовят последовательные разведения клеток, поэтому начать необходимо приблизительно с 1,5 мл суспензии с концентрацией 103 клеток в 1 мл.

6. Достают одну из приготовленных панелей для микротитрования из термостата. В каждую из восьми лунок первого ряда, который содержит только среду ГАТ, добавляют по 100 мкл суспензии с концентрацией 103 клеток в 1 мл. Таким образом, эти лунки содержат по 100 клеток, что обеспечивает постоянный запас клеток, отбираемых из панелей с первым разведением. В лунки второго ряда добавляют по 100 мкл суспензии с концентрацией 102 клеток в 1 мл, поместив таким образом по 10 клеток на лунку. Второй и все -последующие ряды содержат фидерный слой клеток селезенки. В лунки третьего ряда добавляют по 100 мкл суспензии с концентрацией 50 клеток в 1 мл (5 клеток на лунку), в лунки четвертого и пятого ряда — по 100 мкл суспензии с концентрацией 10 клеток в 1 мл (1 клетка на лунку) и в лунки шестого ряда — по 100 мкл суспензии с концентрацией 5 клеток в 1 мл (1 клетка на каждые две лунки). Конечная концентрация 2-меркаптоэтанола в лунках, содержащих спленоциты и гибридные клетки, составляет 60 мкМ.

7. Переносят панель в С02-термостат и повторяют описанную процедуру для второй лунки с клетками, выбранной на панели с первыми разведениями.

8. Меняют в лунках среду, если она в результате роста колоний закислилась. При этом следует соблюдать осторожность, чтобы не нарушить клеточный слой, поскольку гибридные клетки будут затем расти на фидерном слое спленоцитов в виде отдельных колоний. При смене среды необходимо избегать перекрестной контаминации лунок.

9. Через 10—14 дней гибридные клоны следует осмотреть невооруженным глазом, а затем более тщательно, с помощью инвертированного микроскопа под малым увеличением, чтобы различить отдельные белые пятна в лунках. Записывают число колоний, растущих в каждой лунке. Лучше отбирать колонии, выросшие в тех лунках, которые засевали из расчета 1—0,5 клеток на лунку. Однако если эффективность роста данной линии низка, то, возможно, придется выбирать клон из лунок, в которые было посеяно по 10—5 клеток на лунку, при условии присутствия в лунке только одного клона.

10. Когда колонии ясно видны невооруженным глазом, они обычно достаточно большие, чтобы проверить их антителообразующую активность. На. этой стадии проверяют супернатанты

со всей панели. Затем снова, если возможно, проверяют неразбавленный супернатант, а также одно или два разведения. Отбирают три отдельные колонии, которые продуцируют высокие титры антител. Предпочтительно выбирают колонии из тех рядов, в которые изначально клетки были рассеяны из расчета 1 или 0,5 клеток на лунку.

6.4.3. Третья стадия метода лимитирующих разведений

Чтобы быть уверенными, что данные клоны получены из одной клетки, а не из двух, целесообразно повторить описанную выше процедуру второй стадии метода лимитирующих разведений для каждой из трех отобранных колоний. Повторение процедуры клонирования единичных клеток имеет и то преимущество, что при проверке индивидуальных колоний, полученных после третьей стадии процедуры лимитирующих разведений, они все должны продуцировать антитела. Таким образом, гибридомная линия, которую в конечном итоге наращивают до значительных объемов, — это линия, которая образовалась из одной клетки. Целесообразно пересадить три отдельные коло¬нии после осуществления второй стадии метода лимитирующих разведений, поскольку одна или две колонии могут отличаться низкой эффективностью роста. Перенеся три колонии, вы можете быть уверены, что нарастите достаточно клеток для анализа на третьей стадии метода лимитирующих разведений.

Колонии, возникшие из одной единственной клетки, выращенные на третьей стадии и проанализированные на секрецию антител, переносят в новые панели для микротитрования. При известных обстоятельствах предпочтительно сначала вести ли-нию в лунках панели для микротитрования, затем в 2-мл лунках и далее, наконец, в небольших флаконах. По крайней мере 10 ампул следует заморозить в жидком азоте для хранения.

6.4.4. Замечания по процедуре разаедения

На первый взгляд кажется, что описанная выше процедура требует много времени. Результат оказывается наиболее хорошим, если проверяют одно или два разведения супернатанта из каждой лунки и, таким образом, оценивают титр антител. Соответственно в процессе клонирования могут быть отобраны клетки, продуцирующие возрастающее количество антител. В нашей лаборатории с целью отбора проб для приготовления разведений в нестерильных панелях для микротитрования, а также последующего переноса проб в панели для проведения РИА мы используем многоканальную пипетку. Благодаря этому исследование 48 проб из каждой панели занимает совсем немного времени. Имея соответствующие навыки, процедуру лимитирующих разведений можно осуществить за короткое время.

Очень важно детально описывать все этапы культивирования клеток и регистрировать содержание антител в культуральной жидкости во время роста гибридом и по ходу экспериментов по клонированию.

7. Выделение антител из культурального супернатанта и из асцитной жидкости

Моноклональные антитела, полученные с помощью гибридомной технологии, можно выделять из двух источников.

7.1. Культуральная жидкость

Культуральная жидкость не содержит других мышиных иммуноглобулинов, кроме моноклональных антител, но, разумеется, содержит большое количество белков СПК. Концентрация антител в культуральной жидкости обычно составляет несколь-ко мкг в 1 мл. Для получения чистых моноклональных антител все большее применение находят современные бессывороточные культуральные среды.

Для достижения оптимального содержания антител в культуральной жидкости гибридомные клетки растят до высокой плотности (культуральная среда становится при этом желтой). Однако важно не допустить того, чтобы клетки росли до такой степени, чтобы возникла угроза снижения их жизнеспособности и наступила гибель клеток. Культуры гибридных клеток, содержащие высокий процент нежизнеспособных клеток, часто трудно восстановимы и их приходится выбрасывать. Культуральную жидкость собирают и затем центрифугируют при 500 g в течение 5 мин для удаления клеток. Культуральную жидкость, собранную из нескольких флаконов с одной гибридомной линией и полностью освобожденную от клеток, сливают в чистые стеклянные бутыли. Чтобы запасти достаточное количество культуральной жидкости для собственных нужд и снабдить им других исследователей, авторы рекомендуют приготовить 500 мл культуральной жидкости, содержащей 0,1% азида натрия. Так, ее можно хранить при 4°С. Большинство антител в такой культуральной жидкости стабильно. Контролируя содержание антител ее можно использовать в течение нескольких лет.

7.2. Асцитная жидкость, полученная в результате интраперитонеальной инъекции гибридных клеток мышам

1. За 1—3 нед до инъекции клеток гибридомы, выращенных в культуре, мышам линии BALB/c, в возрасте 3—4 мес, проводят интраперитонеальную инъекцию 0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпентадекана; Koch-Light, Великобритания).

2. Каждой мыши вводят по меньшей мере 106, а желательно по 107 клеток в PBS. Гибридома растет в виде асцитной опухоли, и асцитная жидкость содержит антитела в концентрации, приблизительно в 10—500 раз превышающей таковую в культуральной жидкости (концентрация антител в асцитной жидкости составляет несколько мг в 1 мл).

3. Для того чтобы собрать асцитную жидкость, мышь забивают дислокацией шейных позвонков. Делают надрез таким образом, чтобы обеспечить доступ в перитонеальную полость, и дренируют ее пастеровской пипеткой, отбирая асцитную жидкость.

4. Центрифугируют асцитную жидкость (при высоком числе оборотов в минуту) для удаления клеток и клеточного дебриса. Супернатант лучше всего хранить при —20 °С, разлив на аликвоты по 1 мл, либо в большом объеме, если антитела1 будут подвергать дальнейшей очистке.

Разумеется, асцитная жидкость загрязнена другими иммуноглобулинами мыши. Содержание примесей зависит от чистоты содержания животных. Предпочтительно использовать мышей, свободных от видоспецифических патогенных возбудителей, если таковые доступны. Степень загрязнения антител увеличивается и при значительном излиянии крови в асцитную жидкость. Некоторые гибридомы хорошо растут в брюшной полости. Другие же линии, образующие достаточное количество антител в культуре, in vivo продуцируют мало антител, несмотря на хороший рост в виде асцитных опухолей. Некоторые гибридомы формируют солидные опухоли или метастазы. Иногда, еще не достигнув значительного роста, такие опухоли служат причиной гибели хозяинаносителя.

8. Контроль качества: клеточные линии и препараты антител

Первостепенное значение для осуществления контроля ка-чества имеет создание запаса замороженных гибридомных кле-точных линий с указанием даты заморозки. Следует замораживать образцы культивируемых клеток на каждой фазе роста. Образцы асцитных жидкостей следует замораживать с обозначением номера каждого пассажа.

8.1. Замораживание клеток

Ниже представлена простая и эффективная технология за-мораживания.

1. Используют клетки хорошо делящейся, здоровой культуры. Центрифугируют в специальном контейнере приблизитель¬но по 107 клеток на каждую ампулу, которая будет заморо¬жена.

2. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки (в концентрации 1 -107 клеток в 1 мл) в 1 мл холодной СПК, содержащей 5 % диметилсульфоксида. Смесь для замораживания следует приготовить заранее и хранить при —20°С, разлив на аликвоты.

3.         Переносят суспензию клеток в маленькие полипропилено-вые ампулы, которые подписывают, используя несмываемый карандаш, с указанием кода замораживаемой линии и даты.

4.         Помещают замораживаемые ампулы в большую коробку из полистирола с толщиной стенок приблизительно 2—3 см, снабженную крышкой. Коробку переносят в морозильник на —20 °С и оставляют на 30 мин. Подходящими для заморажи¬\

вания контейнерами служат маленькие коробки, в которых лаборатории получают легкобьющиеся материалы. Объемные полистироловые контейнеры обеспечивают медленное охлажде¬ние ампул с клетками (идеально 1 °С в мин) до температуры —20 "С.

5. Спустя 30 мин переносят коробку в морозильник на —70 "С и оставляют либо на 6 ч, либо на ночь. Затем ампулы переносят в контейнер с жидким азотом для хранения.

Согласно альтернативной методике замораживания, поли-пропиленовые пробирки переносят в 50%-ный глицерин, охлаж-денный до —32 °С. Спустя 40 мин пробирки извлекают, проти-рают тканью и переносят непосредственно в контейнер с жид¬ким азотом.

8.2. Размораживание клеток

1.         Чтобы восстановить культуру, нужно быстро разморозить пробирки, держа их в струе горячей воды из крана и легко по-качивая до тех пор, пока лед в пробирке почти не исчезнет.

2.         Клетки переносят в универсальный контейнер и затем медленно, по каплям, добавляют 2 мл теплой (37 °С) среды H-RPMI.

3.         Закрывают контейнер крышкой и перемешивают содер-жимое. Центрифугируют в течение 5 мин приблизительно при 500 g.

4.         Удаляют супернатант, заливают клетки 4 мл среды ГАТ и помещают суспензию в две лунки панели для культуры тка¬ней объемом 2 мл.

5.         Панели инкубируют в термостате с регулируемым соста¬вом атмосферы, а затем рассевают клетки. Жизнеспособность клеток обычно составляет 50—78% при условии, что была за¬морожена здоровая, хорошо растущая (непереросшая) куль¬тура.

Время от времени необходимо проверять содержание специ-фических антител в культуральной жидкости с помощью опре-деленного набора контрольных антигенов. Очень важно оценить не только уровень специфических антител, но и возможных примесей. Обнаружение последних может быть обусловлено за-грязнением гибридомы клетками другой линии, что легко может случиться, когда одновременно культивируют много линий.

' Асцитные жидкости можно хранить в замороженном виде, но в этом случае отпадает необходимость в соблюдении сте¬рильности (препараты будут использованы для последующих в/б инъекций), которая должна быть обеспечена при замора¬живании клеток для последующего культивирования in vitrp. После центрифугирования асцитной жидкости осадок ресуспен¬дируют в PBS, а не в среде ГАТ.

Самый простой путь определения концентрации моноклональных иммуноглобулинов в асцитных жидкостях — электро-форез с последующим окрашиванием гелей. На электрофоре-грамме должны быть видны отдельные полосы, характеризую¬щиеся определенным положением в случае антител данной специфичности. Их интенсивность можно сравнить с интенсив¬ностью полос, полученных при исследовании проб, отобранных на более ранних пассажах. Данный метод более удобен и ин¬формативен, чем титрование специфических антител, хотя время от времени следует применять и последний.

9. Применение моноклональных антител

Клиническое и экспериментальное применение моноклональных антител разнообразно и многочисленно. Ряд обзоров полностью посвящены этой теме и могут быть рекомендованы читателю [2, 4, 6]. Здесь мы рассмотрим практические выводы, имеющие отношение к использованию моноклональных антител.

Во-первых, в зависимости от области применения существу¬ет возможность выбора наиболее подходящего и удобного ис-точника получения моноклональных антител: культуральной или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцит¬ной жидкости возникают определенные трудности при интер¬претации полученных результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют разведение 1 :1000 или более, значительная часть посторонних мышиных антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из препарата примесь естественных иммуно¬глобулинов (например, при использовании моноклональных ан¬тител для выделения и очистки небольшого количества белко¬вого антигена с целью биохимического анализа). В последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из культуральной жидкости. При использовании в иммунологиче-ских реакциях асцитной жидкости следует иметь в виду при-сутствие посторонних фоновых антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий титр природ¬ных антител, реагирующих с антигеном, специфически распо-знаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например, культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в иммуногистологических исследованиях.

Культуральная жидкость представляет собой удобный и адекватный источник моноклональных антител с целью использования их для идентификации антигена как в собственной лаборатории, так и для снабжения этим реагентом коллег. При использовании одной капли чистой культуральной жидкости на тест, 10 мл достаточно для проведения приблизительно 200 тес¬тов. Если моноклональные антитела получают коммерческим путем или используют в крупномасштабных исследованиях в ряде центров, то наиболее экономичным источником их полу-чения служит асцитная жидкость. При использовании одной капли на тест и при работе с разведением около 1 : 10\ 1 мл хватает на 20 000 тестов. В этом случае моноклональные ан-титела обычно выделяют из асцитной жидкости в виде иммуно-глобулиновой фракции.

В разд. 5 мы рекомендовали выбирать метод скрининга, адекватный использованию МКА. Следует иметь в виду, что в неадекватных системах МКА иногда не обнаруживают антиге¬на. Например, моноклональные антитела к растворимым бел¬кам, отобранные методом пассивной гемагглютинации с по¬мощью эритроцитов, нагруженных антигеном, могут распозна¬вать только одну антигенную детерминанту. Такие антитела не обладают преципитирующими свойствами. В таком случае пре-ципитация антигена достигается при использовании комбинации моноклональных антител различной специфичности, которые распознают две различные детерминанты на молекуле белка.

Дальнейшие исследования возможностей использования мо-ноклональных антител неожиданно встретили затруднения, обусловленные распознаванием моноклональными антителами только нативной формы антигена. Например, моноклональные антитела к клеточным антигенам часто не распознают антиген, перенесенный на нитроцеллюлозную мембрану с полиакрил-амидных гелей после проведения электрофореза растворимых клеточных экстрактов в присутствии ДСН. В данном случае антиген денатурируется и поэтому не связывается с антитела¬ми. Подобным образом моноклональные антитела, которые окрашивают клетки в суспензии, могут оказаться непригодны¬ми для иммуногистологических исследований парафиновых сре¬зов зафиксированного формалином материала. Эти соображе¬ния наводят на мысль, что как выбор метода скрининга, так и природа материала, используемого для иммунизации мышей, являются важными факторами, влияющими на свойства полу¬ченных в конечном итоге моноклональных антител.

Серологические свойства моноклональных антител не всегда можно предсказать по известным серологическим свойствам адсорбированных поликлональных антисывороток. В случае поликлональных реагентов взаимодействие с антигеном осуще-ствляется благодаря комбинированному эффекту различной специфичности антител, которые 6 совокупности идентифициру-

ют определенные типы клеток или белков и не распознают другие образования и структуры. Моноклональные антитела к корпускулярным антигенам или гликопротеинам могут прояв¬лять неожиданные серологические свойства, а именно окраши¬вать различные клетки или же связывать большое число раз-нообразных гликопротеинов. Такие антитела, как правило, распознают специфические углеводные структуры, которые мо-гут входить в состав самых разнообразных белков. Примером служит углеводная структура З-фукозил-М-ацетиллактозамина, которая может быть обнаружена в кислом гликопротеине a-U лактоферрине, а-амилазе секрета околоушной железы, церви-кальном муцине и в секреторном компоненте. Моноклональные антитела различной специфичности могут найти практическое применение во многих областях биологии и медицины. С по¬мощью серологических исследований следует предварительно определить, что определенные моноклональные антитела действительно проявляют специфичность именно в данной тестирующей системе.

В целом использование моноклональных антител в экспери-ментальных и клинических исследованиях помогает устранить проблему, связанную с неспецифическими реакциями обычной поликлональной антисыворотки, обусловленными присутствием посторонних антител, а также связыванием с антигеном ком-понентов неиммуноглобулиновой природы. Однако, как бы¬ло сказано выше, исследователю может потребоваться более одного препарата моноклональных антител, специфичных к оп-ределенному антигену, с тем чтобы использовать такую ком-бинацию антител для проведения широкого спектра экспериментов.

10. Перспективы исследований

Гибридомная технология интенсивно развивается. По-видимому, менее чем через десять лет будет получено около 10 различных типов моноклональных антител различной специфичности, синтезированных гибридомами, полученными при слиянии клеток крыс и мышей. Большинство из этих гибридом будет рассредоточено во всем мире по отдельным лабораториям. Очевидно, в пределах различных центров некоторые виды гибридом будут многократно дублироваться. Это создает проблему иного плана, чем просто явное повторение. Важным свойством моноклональных антител является то, что они могут быть получены в количествах, достаточных для снабжения ими большого числа лабораторий, занимающихся сходными или дополняющими данную тему анализами. Результаты этих исследований можно сопоставить и сравнить. Однако часто различные лаборатории используют свои собственные моноклональные антитела для идентификации одного и того же антигена. Это определенно затрудняет возможность сопоставлять данные, полученные в различных центрах. Данная проблема может быть решена с помощью проведения международных рабочих совещаний, на которых несколько лабораторий имеют возможность сравнить свойства моноклональных антител при использовании различных технических приемов. Например, было получено множество различных моноклональных антител к человеческим лейкоцитарным антигенам. Два рабочих совещания (Париж, 1983; Бостон, 1984) организовали тестирование моноклональных антител к антигенам Т-, В-лимфоцитов и клеток миелоидного ряда в цитологической, гистологической и биохимической системах. В результате различные образцы МКА, реагирующие с одним и тем же дифференцировочным антигеном, объединили в группы (кластеры), которым присвоили определенный номер; кроме того, частично были охарактеризованы антигенымишени. На еще одном, недавно проведенном рабочем совещании были охарактеризованы моноклональные антитела к подклассам IgG человека. Учитывая вышесказанное, можно заключить, что следует продолжать организацию и проведение подобных совещаний. Некоторые препараты моноклональных антител можно приобрести коммерческим путем, однако, к сожалению, зачастую по высокой цене. В какой-то степени это, возможно, будет способствовать получению таких .антител в самих центрах при условии, что для крупномасштабных исследований гораздо более выгодно производить свои собственные реагенты. Значительно облегчает работу в области гибридомной технологии и то обстоятельство, что в специальных центрах в США (American Type Collection) и в Европе имеются коллекции замороженных, классифицированных по группам гибридомных клонов, которые предоставляются на коммерческой основе всем заинтересованным лицам. Таким образом, многие антитела, которые в настоящий момент чрезмерно дороги, неизбежно станут намного дешевле благодаря наличию альтернативных клонов той же самой специфичности у исследователей-альтруистов и организаторов рабочих совещаний. Однако, даже если цена клона вполне доступна, культивирование его и хранение для последующего использования требуют все же значительных затрат. Поэтому существует боль¬шая необходимость в поиске более дешевых путей сохранения клеток животных.

Терапевтическое применение моноклональных антител in vivo — это обширная область, представляющая значительный интерес. Для этой цели, очевидно, более предпочтительно ис-пользование моноклональных антител человека. Моноклональ-ные антитела могут быть, например, использованы для диагностики опухолей или элиминации опухолевых клеток. Однако получение клеток плазмацитомы человека для экспериментов по гибридизации натолкнулось на неожиданные трудности. Альтернативным подходом к получению клеточных линий человека, секретирующих моноклональные антитела, может служить методика трансформации с помощью ВЭБ. В настоящее время в этой области известно значительное число работ, что гарантирует применение новых подходов. В случае успеха появится возможность выявления многих антигенов (например, HLA), отличных от тех, которые уже были охарактеризованы с помощью антител мыши.

Литература

1. Kohler С, Milstein С. Nature, 256, 495 (1975).

2. Yelton D. Е., Margulies D. H., Diamond В., Scharff M. D. In: Monoclonal Antibodies: Hybridomas — A New Dimension in Biological Analyses, Ken-nett R. H., McKearn T. J. and Bechtol К. B. (eds.), Plenum Press, New York, p. 3, 1980.

3. Kozler D., Roder J. C. Immunol. Today, 4, 72 (1983).

4. Galfre G., Milstein C. In: Properties of the Monoclonal Antibodies Produced by Hybridoma Technology and Their Application to the Study of Diseases, Houba V. and Chan S. H. (eds.) UNDP/World Bank/WHO, p. 1, 1982.

5. Kennett R. H., Davis K. A., Tung A. S., Klinman N. R. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 77 (1978).

6. Bastin J. M., Kirkley J., McMichael A. J. In: Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, McMichael A. J. and Fabre J. S. (ed.), Academic Press, New York, p. 503, 1982.

7. Westerwoudt R. L, Blom J., Naipal A. M., Van Rood J. J. J. Immunol. Met¬hods, 62, 59 (1983).

8. Fisher A. G., Bunce С. M., Toksoz D., Stone P. C. W., Brown G. Clin. Exp. Immunol., 50, 374 (1982).

9. Sarnesto A., Ranta S., Seppala I. J. Т., Makeld 0. Scand. J. Immunol., 17, 507 (1983).

10. Phillips D. J., Reimer С. В., Wells T. W., Black С. M. J. Immunol. Methods, 3, 315 (1980).

11. Galfre G., Howe S. C, Milstein C, Butcher G. W., Howard I. C. Nature, 266, 550 (1977).

12. Schroder J. W., Nossal G. J. V. Immunol. Rev., 53, 61 (1980).

13. Brown G., Kourilsky F. M., Fisher A. G., Bastin J., MacLennan I. С. M.Hum.Lymphocyte Differ., 1, 167 (1981).

14.  Anderson К. С Park E. K., Bates M. P., Leonard R. C. F., Hardy R., Schlos-sman S. F., Nadler L. M. J. Immunol., 130, 1132 (1983).

15. Ling N. R., Bishops S., Jefferies R. J. Immunol. Methods, 15, 279 (1977).