|
ОКРАШИВАНИЕ НЕЙРОНОВ
Окрашивание метиленовым синим, которое Ниссль положил в основу изучения эквивалентной картины нервных клеток, основано на перекрашивании фиксированных в спирте срезов основным анилиновым красителем с последующим отмыванием его избытка спиртом. При этом составные части клеток сильнее удерживают краситель, чем масса волокон, которая дифференцируется быстрее. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне. В окрашивании клеток участвуют как ядерные структуры, так и вещества, находящиеся в цитоплазме нервных клеток,— тигроидные глыбки; глыбки, или вещество Ниссля.
Под эквивалентной картиной клетки F. Nissl понимал «картину микроскопической структуры имеющихся в ткани нервных клеток животного, убитого определенным образом, которая может быть закономерно воспроизведена при определенной микротехнике обработки нервной ткани, находящейся в определенных экспериментальных условиях».
Со временем метод Ниссля был упрощен. Даже основное требование F. Nissl - фиксация препаратов этиловым спиртом — выполняют частично, поскольку метод часто применяют для обработки материала, фиксированного в формалине. Однако в ответственных случаях следует рекомендовать по возможности проводить окрашивание материала, который был фиксирован по прописи в спирте. Что же касается указаний F. Nissl о резании и окрашивании, то их вполне можно заменить без ущерба для результата обычным спирт-целлоидиновым методом и более контрастным окрашиванием толуидиновым синим или тионином.
Метод Ниссля
Фиксация.
Острыми ножницами вырезают кусочки ткани мозга в форме кубиков и сразу, без соприкосновения с водой, помещают в большое количество 96 % спирта. Кусочки не должны быть ни слишком большими, ни слишком маленькими (длина сторон не менее 1 см). Важно, чтобы кусочек ткани со всех сторон омывался спиртом (положить на вату), который в 1-й день нужно сменить, по крайней мере, 1 раз, в дальнейшем обновлять каждые 2 дня.
Получение срезов.
Через 5 дней блок обычно достигает необходимой консистенции. Его сторону, предназначенную для наклейки, ровно срезают острой бритвой так, чтобы толщина блока не была более 6 — 8 мм, размер плоскости среза может быть любым. На ровную поверхность деревянной колодки, служащую для наклейки, наносят раствор гуммиарабика консистенции меда. Поверхность кусочка мозга промокают фильтровальной бумагой и легким нажимом вдавливают в раствор гуммиарабика так, чтобы он всюду хорошо прилегал к деревянной колодке. Затем блок переносят обратно в 96 % спирт, где гуммиарабик белеет и быстро уплотняется. Через несколько минут блок можно резать.
Блок режут косо поставленным ножом, смоченным спиртом, причем стараются срезы толщиной 10—15 мкм по возможности полностью расправить с помощью смоченной спиртом кисточки. Срезы собирают в чашку с 96 % спиртом. Долго хранить их в спирте нельзя, следует сразу же подготовить к окрашиванию. Блок, наоборот, можно хранить в спирте довольно долго: для этого его нужно снять с деревянной колодки.
-----------------------------------------------------------------
Окрашивание срезов.
Срезы окрашивают в часовом стекле с красящим раствором, в состав которого входят 3,75 г метиленового синего В, 1,75 г наскобленного венецианского мыла (оливковое мыло), 1 л дистиллированной воды. Красящий раствор осторожно подогревают до появления паров. Затем расправленные срезы переносят для дифференцировки в свежеприготовленную смесь из 10 мл совершенно прозрачного анилинового масла и 90 мл 96 % спирта. Дифференцируют до прекращения отхождения крупных облачков краски. Затем срез помещают на предметное стекло, просушивают гладкой фильтровальной бумагой, быстро покрывают кайепутовым маслом, снова просушивают, поливают бензином (не давать подсохнуть!) и покрывают канифолью с ксилолом (насыщенный раствор канифоли в ксилоле). Предметное стекло осторожно подогревают до испарения ксилола, после чего на еще горячий слой канифоли накладывают подогретое покровное стекло. Красящий раствор перед использованием взбалтывают и фильтруют.
Свежеприготовленный красящий раствор должен созревать не менее 3 мес. Этот метод является основной высоко специфической методикой окрашивания нервных клеток для изучения в них выраженных патологических и структурно-функциональных изменений в световом микроскопе. Основу его составляет способность выявлять с помощью основных красителей специфичный для нейронов нуклеопротеидный комплекс (тигроид), содержащийся в цитоплазме и дендритах, а также другие комплексы РНК и основных белков (ядрышко, хроматин ядра).
-----------------------------------------------------------------
Упрощенный метод Ниссля
Фиксированный в спирте материал заливают в спирт-целлоидин.
Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время.
Методика окраски
1. Расправленные срезы помещают в 0,1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров.
2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте.
3. Дифференцируют в 96 % спирте.
4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом.
5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой.
6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают.
7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам.
Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно-синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено.
-----------------------------------------------------------------
Метод Ниссля в модификации Снесарева
Одновременно с нервными клетками на препаратах, окрашенных по Нисслю, выявляются клеточные элементы мягкой мозговой оболочки и ее сосудов, внутримозговых сосудов, ядра глии и инфильтративные клетки, липофусцин, зеленый пигмент, 6азофильные коагуляты в сосудах, протоплазменная реакция астроцитов. Метод Ниссля также может быть использован для предварительной диагностики нейроэктодермальных опухолей и паразитарных поражений мозга.
Срезы материала, залитого в целлоидин, получают на санном микротоме. Толщина срезов 8-10 мкм. Их хранят в 96 % спирте.
Методика окраски
1. Срезы в 96 % спирте подогревают на водяной бане до появления пузырьков и охлаждают.
2. Переносят в 0,2 % раствор тионина, подогревают до появления паров и охлаждают.
3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды; проводят через 2 смены 96 % спирта (до побледнения срезов) по 30 —40 с в каждой.
4. При недостаточной дифференцировке тионина в спиртах проводят через эвкалиптовый спирт (10 мл 96 % спирта + 1 капля эвкалиптового масла) 3-5 с; тщательно ополаскивают в 3 сменах 96 % спирта, проводят через спирт-ксилол (2 части ксилола и 1 часть 96 % спирта), 100 % спирт-ксилол, ксилол.
5. Переносят на предметное стекло и заключают в бальзам.
6. Готовые препараты укладывают на доски и держат на свету до просветления фона (контроль под микроскопом).
Раствор тионина. Готовят из 1 г тионина и 500 мл дистиллированной воды. Тионин растирают в ступке в течение 45-60 мин, добавляя по каплям подогретую дистиллированную воду. Затем доливают оставшуюся дистиллированную воду, подогревают, доводят до кипения и фильтруют через 6 фильтров.
Перед использованием приготовленного раствора тионина его также следует профильтровать. Использованный краситель сливают в отдельный сосуд, так как он может быть вновь использован.
Результаты: на светлом фоне выявляются нервные клетки сине-фиолетового цвета различных оттенков.
-----------------------------------------------------------------
Метод Ниссля отличается постоянством и большой надежностью результатов. Основой его успешного использования являются правильная фиксация материала и, что особенно важно, тщательное обезвоживание в спиртах восходящей концентрации при заливке в целлоидин или парафин. При несоблюдении этих условий препараты дают неотчетливое изображение, имеют зеленый оттенок и быстро обесцвечиваются.
| 
