ВЫЯВЛЕНИЕ ГАНГЛИЕВ И ИХ ОТРОСТКОВ

Среди методов импрегнации металлами первое место занимают методы импрегнации серебром Гольджи. Они основаны на образовании соединений серебра, которые осаждаются на отдельных ганглиозных клетках и их отростках, а также часто на глиальных клетках, сосудах и других образованиях. Наиболее распространен так называемый быстрый метод Гольджи. Во многих случаях вместо него можно использовать простой метод серебрения Шультце. Недостатком, но в то же время и достоинством метода Гольджи является то, что импрегнация никогда не распространяется на все клетки, ограничиваясь отдельными элементами. Благодаря этому получается картина, хотя и не полная, но более ясная, чем если бы были выявлены все клетки.

Метод Гольджи имеет большое значение не только для импрегнации нервных клеток, но и для выявления нервных окончаний, секреторных капилляров, железистых ходов, границ клеток и т.п. Хотя метод Гольджи позволяет получить лишь теневую картину, в соответствующих случаях с его помощью с успехом выявляют разнообразные тканевые элементы. При его использовании, конечно, нужно постоянно сознавать, что выявление структур основано на образовании осадка, который при известных обстоятельствах может дать картину не существующих в действительности структур. Нужно также учитывать, что выявленные клетки или структуры могут оказаться неполно импрегнированными. Какие именно образования будут импрегнированы, является в известной степени делом случая, так как условия, при которых происходит образование осадка, к сожалению, еще недостаточно известны. В связи с этим для правильной оценки полученных результатов требуются знания и опыт.

-----------------------------------------------------------------

Ускоренный метод Гольджи

1. Кусочки ткани, по возможности свежей, помещают в смесь из 40 мл 2,5 % (до 3,5 % по Кахалю) бихромата калия и 10 мл 4 % тетраоксида осмия при 20 — 25 °С в коричневую склянку на стек­лянную вату так, чтобы жидкость проникала со всех сторон. Указанного количества, жидкости достаточно для 5 — 6 кусочков. Ку­сочки не должны быть слишком большими или слишком малень­кими (толщина 2 — 3 мм, площадь поверхности 5 — 10 мм2).

Продолжительность воздействия заранее нельзя указать, так как для каждого объекта она различна, поэтому всегда кладут в смесь большое количество кусочков и вынимают их из раствора в течение 2 — 7 дней с промежутками около 12 ч.

2. Кусочки обсушивают фильтровальной бумагой и погружают в небольшое количество 0,75 % раствора нитрата серебра, который в случае необходимости несколько раз меняют до пре­кращения образования осадка, затем помещают на 1 — 2 дня (на 1-6 дней по Рамон-и-Кахалю) в 100 мл 0,75 % раствора нитрата серебра при комнатной температуре или 35 °С (не выше), лучше в темноте.

3. Промывают в 40 % спирте (1 —2 ч), сменяя его несколько раз. Переносят в 80 % и 96 % спирты. Затем кусочки зажимают в уплотненную печень или проклеивают гуммиарабиком и режут бритвой или на микротоме, смачивая спиртом (толщина срезов 20-100 мкм). Если кусочки после уплотнения в спирте перенести обратно в воду, то их можно резать и на замораживающем микротоме. Кусочки можно также быстро залить в целлоидин, для чего их обезвоживают в 100 % спирте 12 ч, спирт-эфире 2 —4 ч, 4 % целлоидине 1 — 2 дня, накладывают на деревянный или лучше стабилитовый блок, обливают густым раствором целлоидина и уплотняют на воздухе или в 80 % спирте. Если ткань при резке сильно крошится, то блок после каждого среза смазывают жидким раствором целлоидина.

Кусочки также можно поместить на 1—4ч в 100% спирт, на 1 ч в смесь 100 % спирта и эфира (1:1), а затем на несколько часов в жидкий целлоидин (в сосуд со свободно сидящей пробкой). После этого объект уплотняют в парах хлороформа и режут в 96 % спирте.

Срезы тщательно промывают в 80 % спирте для удаления избытка серебра, обезвоживают в абсолютном спирте, просветляют в креозоте, а затем в скипидаре.

После этого срезы переносят на покровное стекло, осторожно отсасывают масло и наносят каплю густого бальзама, которую распространяют по всему препарату. В таком виде препарат оставляют на несколько дней сохнуть в месте, защищенном от пыли, и, наконец, укрепляют покровное стекло срезом вниз на продырявленном предметном стекле или деревянной дощечке. Таким образом, препарат не следует заключать между предметным и покровным стеклами, так как в этом случае импрегнация разрушается в короткий срок.

Результат: при удавшейся импрегнации на светлом фоне выделяются отдельные темно-черные ганглиозные клетки вместе с отростками.

Наиболее легко удается импрегнация ганглиозных клеток на материале, взятом от молодых животных (поздние эмбрионы, 1 —10-дневные животные). Особенно благоприятными объекта­ми являются головной и спинной мозг птенцов голубя.

Выраженное влияние на результаты оказывает продолжительность хромирования. Точные рекомендации, к сожалению, дать невозможно, так как для каждого объекта она различна и зависит от состояния препарата, температуры, концентрации, количества жидкости и др. Сроки устанавливают чисто эмпирически: для ганглиозных клеток ЦНС обычно 3 — 5 дней, для глии 2-3 дня, для нервных волокон 5-7 дней. 

При слишком кратковременном хромировании появляется лишь диффузный осадок хромата серебра, при слишком длительном находят только резко отграниченные кристаллы, импрегнация же отсутствует.

Кусочки ткани обычно окружены толстым слоем осадка серебра, который может затруднять наблюдение, особенно в случае тонких препаратов мембран, так как покрывает большую часть препарата. В связи с этим перед помещением кусочков в раствор нитрата серебра целесообразно несколько раз быстро погрузить их в 10 % раствор желатина, т.е. окружить желатиновой оболочкой. После серебрения от желатина освобождаются путем быстрого погружения кусочков в теплую воду, насыщенную хроматом серебра.

Объекты, находившиеся слишком долго в растворах, содержащих хром, еще могут быть пригодны для импрегнации по Гольджи, если их обрабатывать в течение 1-14 дней в часто сменяемой смеси равных частей 2-3 % раствора бихромата калия и 4-5 % раствора сульфата меди; из этой смеси объект переносят в ванну с нитратом серебра.

Надежность метода Гольджи повышается при 2- или 3-кратном импрегнировании по Кахалю. Благодаря этому часто можно «спасти» импрегнацию, оказавшуюся в первый раз неудачной.

При повторном импрегнировании поступают так, как при использовании метода Гольджи (быстрого). Обсушивают кусочек на фильтровальной бумаге и помещают в ранее использовавшуюся смесь бихромата калия и тетраоксида осмия, а затем на 1 сут в раствор нитрата серебра, применявшийся ранее. Ополаскивают дистиллированной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Погружают на 1-2 мин в 96 % спирт, обсушивают фильтровальной бумагой. Делают блок с помощью гуммиарабика или парафина и режут, смачивая 96 % спиртом. Толщина срезов 80—100 мкм; срезы промывают в 96 % спирте, сменяемом 5-6 раз, в общей сложности не дольше 30 мин. Переносят на предметное стекло, прижимают фильтровальной бумагой и заключают (по методу Гольджи). Приведенные выше процедуры можно повторить и в 3-й раз.

-----------------------------------------------------------------

Медленный метод Гольджи

Маленькие кусочки органов помещают в жидкость Мюллера или 3 % раствор бихромата калия, концентрацию которого постепенно повышают до 5 % (в сосуде из коричневого стекла). Через 4 — 6 недель проводят первую пробу; для этого один кусочек обсушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают в 0,75 % растворе нитрата серебра, а затем кладут в такой же раствор на 24 ч. Если на сделанных бритвой срезах с материала не обнаруживают никакой импрегнации, то пробу повторяют через 8 дней. После того как наступит импрегнация, материал обрабатывают по методу Гольджи, начиная с пункта 3.

Специальные методики импрегнации нервных клеток с отростками и контактным аппаратом

Оригинальная методика Гольджи

Данная методика является основной в изучении тонких структурных особенностей дендритов, шипиков и аксонной системы нейронов, позволяет более полно выявить морфологические особенности нейронов и межнейрональных связей.

1. Кусочки ткани мозга фиксируют в 10 % формалине от 1 до 15 дней. Увеличение продолжительности фиксации в формалине ухудшает качество импрегнации. Толщина кусочков не должна превышать 3 — 3,5 мм.

2. Фиксированные в 10 % формалине кусочки переносят (без промывания) на 3 сут в жидкость Мюллера в термостат.

3. Помещают (без промывания) в фиксатор, состоящий из 5 мл 1 % тетраоксида осмия и 25 мл 3 % бихромата калия, который готовят непосредственно перед использованием, ставят бюкс с притертой крышкой на 2 дня в термостат при температуре 37 °С. Для фиксации одного кусочка требуется не менее 30 мл указанной смеси.

4. Промывают кусочки в 2 сменах 1 % раствора нитрата серебра, приготовленного на 20 % растворе глюкозы.

5. Кусочки переносят в баночки из темного стекла на стеклянную вату и осторожно наливают раствор нитрата серебра на глюкозе (на 1 кусочек примерно 40 — 50 мл раствора). Обращаться с кусочками следует с большой осторожностью: брать их можно только пластмассовой или стеклянной лопаточкой, не следует пользоваться металлическим шпателем. Импрегнацию кусочков проводят в течение 14 — 20 дней в теплом месте.

Заливку в целлоидин проводят в течение 2 сут. Кусочки вырезают и наклеивают на блоки. Для более полного использования кусочков рекомендуется сделать на блоке подкладку из целлоидина, на которую кладут кусочек и заливают густым целлоидином. Кусочки подсушивают в парах хлороформа и помещают в 70 % спирт. Проводку по спиртам и заливку в целлоидин осуществляют в темноте, для этого баночки с кусочками следует покрыть колпачками из черной бумаги.

7. Режут кусочки на санном микротоме (толщина срезов 90—120 мкм). Серии срезов снимают с ножа кисточкой и помещают в 96 % спирт в чашки Петри, расправляя срезы кисточкой.

8. Каждый срез ополаскивают отдельно в 96 % спирте, затем переносят последовательно в две порции абсолютного спирта — в каждую на 30 мин.

9. Из 100 % спирта срезы переносят кисточкой на большие (60 х 90 или 32 х 40 мм) покровные стекла. Укладывают срезы в порядке серии. Стекла со срезами помещают в чашки Петри и осторожно заливают профильтрованным эвкалиптовым маслом. Если срезы при этом всплывают на поверхность, то их следует кисточкой вновь опустить на покровное стекло, помещенное на дно чашки Петри. В эвкалиптовом масле срезы должны находиться до просветления в течение 24 ч в темном месте. Эвкалиптовое масло можно использовать несколько раз (после фильтрации) до тех пор, пока оно не потемнеет.

Перед заключением в бальзам масло сливают, промокают срезы на покровных стеклах фильтровальной бумагой и заливают ровным слоем густого бальзама. После того как бальзам подсохнет (примерно в течение 3 сут), по краям покровного стекла со стороны бальзама приклеивают стеклянные, парафиновые или спичечные ножки.

Для приготовления жидкости Мюллера 3 г бихромата калия растворяют в 100 мл дистиллированной воды, можно подогреть, затем остудить и добавить 1 г сульфата натрия. Фильтровать раствор не нужно. Раствор хранят в темной стеклянной банке.

Результаты: на светло-желтом фоне выявляются нейроны с дендритами и аксонной системой, интенсивно импрегнированные в черный цвет.

-----------------------------------------------------------------

Метод Гольджи—Дейнеки 

(для выявления синапсов)

1. Материал фиксируют в свежем растворе АФА (состоит из равных частей 96 % спирта, 20 % нейтрального формалина и насыщенного раствора мышьяковистой кислоты) до 3 ч.

2. Промывают в 1 % растворе нитрата серебра и оставляют в этом растворе на срок от 18 дней до 2,5 мес.

3. Промывают в дистиллированной воде 3 — 4 мин.

4. Переносят в восстановительную смесь, в состав которой входят 2 г гидрохинона, 0,5 г сульфита натрия, 5 мл 40 % нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, на 1 сут.

5. Промывают в дистиллированной воде.

6. Проводят через 70 %, 80 %, 96 % спирты по 3 ч в каждом и оставляют в 100 % спирте на ночь.

7. Переносят в 6 % целлоидин на 2 — 3 сут, затем в 8 % целлоидин на 2 сут (лучше только в 6 % целлоидин на 2 — 3 сут).

8. После заливки на блоках готовят срезы толщиной от 15 до 30 мкм и переносят их в 70 % спирт.

9. Промывают срезы в дистиллированной воде и погружают до почернения в вираж (1,5 г тиосульфата натрия, 1,5 г тиоцианата аммония, 50 мл дистиллированной воды, на каждые 10 мл виража 1 мл 1 % трихлорида золота).

10. Промывают 10 — 30 мин водопроводной, затем дистиллированной водой.

11. Дифференцируют до просветления в растворе перманганата калия (2 — 3 кристалла на 50 мл дистиллированной воды + 1 капля серной кислоты).

12. Не промывая срезы, погружают их в 1 % раствор щавеле­вой кислоты на 1 — 3 мин (щавелевая кислота отмывает перманганат калия).

13. Промывают дистиллированной водой и переносят в спирты восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %) по 2 —3 мин.

14. Проводят через карбол-ксилол 1—2 мин, 2 — 3 порции ксилола и заключают.

Результат: фон препаратов светлый, тела нейронов и дендриты светло-серого цвета. Аксонные синаптические окончания импрегнируются интенсивно, дендриты — более интенсивно.

 -----------------------------------------------------------------

Метод Гольджи в модификации Блиновой

1. Материал фиксируют в 10 % формалине от 1 мес до 1 года (получены удовлетворительные результаты при фиксации в формалине более 1 года).

2. Кусочки ткани переносят в 2 % раствор бихромата калия (готовят на дистиллированной воде) на 2 сут в термостат при 25-30 °С.

3. Промывают в двух сменах 4 % раствора нитрата серебра, приготовленного на 20 % растворе глюкозы.

4. Помещают в такой же раствор нитрата серебра на 4-5 сут при комнатной температуре в темном месте.

5. Не меняя раствор нитрата серебра, баночки с кусочками ткани переносят в термостат при 24-30 °С на 1 сут (более продолжительная импрегнация кусочков ткани в термостате ухудшает качество препаратов)

6. Кусочки ткани переносят в дистиллированную воду и получают срезы толщиной 40-50 мкм на замораживающем микротоме.

7. Обезвоживают срезы в спиртах восходящей концентрации (70%, 80%, 96%) и в 2 порциях 100 % спирта, проводят через ксилол, заключают в бальзам под покровное стекло.

Для приготовления 4 % раствора нитрата серебра на 20 % растворе глюкозы растворяют 20 г глюкозы (можно заменить сахарозой) в 100 мл дистиллированной воды. В этот раствор добавляют 4 г нитрата серебра. В случае выпадения осадка раствору дают отстояться непосредственно перед применением. Подобным образом готовят и 1 % раствор нитрата серебра на 20 % растворе глюкозы.

Результат: на светло-желтом или почти бесцветном фоне нейроны с  дендритами и шипиками на них окрашены в интенсивно-черный цвет.

-----------------------------------------------------------------

Метод Гольджи—Кокса (для животных)

1. Животное анестезируют нембуталом (эфир применять нельзя) в летальных дозах, затем берут кусочки головного мозга, быстро ополаскивают в теплом изотоническом растворе хлорида натрия и помещают в 50 мл следующей смеси: 20 мл 5 % раствора бихромата калия, 20 мл 5 % раствора сулемы, 40 мл дистиллированной воды. К этой смеси при постоянном помешивании добавляют 8 мл 5 % раствора бихромата калия. Кусочки в этом растворе помещают на стеклянную вату. Банки хранят в темном месте при комнатной температуре (не перемешивая) в течение 8 нед. Для коры головного мозга кошки, котенка и крысы этот срок меньше.

2. Кусочки без промывания ополаскивают в смеси равных количеств ацетона и 100 % спирта, затем помещают в такую же смесь на 24 ч в закрытой посуде.

3. Переносят в смесь равных количеств 100 % спирта и эфира на 4 ч.

4. Помещают в 5 % целлоидин на 24 ч, затем в 12 % целлоидин на 12 ч. Заливают на блоки и укрепляют хлороформом.

5. Срезы толщиной 100 — 120 мкм режут на микротоме в 70 % спирт.

6. Доводят до дистиллированной воды.

7. Осуществляют редукцию в 5 % растворе сульфата калия (к большому объему раствора добавляют несколько капель 5 % раствора щавелевой кислоты) для просветления фона и его обесцвечивания.

8. Промывают в дистиллированной воде в течение 5 мин. Проводят в смеси равных количеств спирта и хлороформа и наклеивают на предметное стекло 1 % раствором целлоидина.

9. Стекла со срезами проводят через смесь равных количеств абсолютного спирта и хлороформа.

10. Просветляют в скипидаре и заливают в бальзам.

-----------------------------------------------------------------

Метод Глисса в модификации Владимировой

1. Небольшой кусочек ткани головного мозга погружают в жидкость Бодиана (5 мл формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 90 мл 80 % спирта) на 3 — 4 дня.

2. Промывают в проточной воде в течение 24 ч.

3. Срезы толщиной 12 — 15 мкм получают на замораживающем микротоме, ополаскивают в дистиллированной воде и помещают на 24 ч в 50 % спирт, добавив в него 10 капель крепкого аммиака.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде и помещают в 10 % раствор нитрата серебра на срок от нескольких часов до 5 дней (пока срез не станет коричневым).

5. Не ополаскивая, переносят в 10 % формалин, меняя его несколько раз, пока не исчезнет муть.

6. Ополаскивают в проточной воде.

7. Погружают на 30 с (можно до 1 мин) в смесь, состоящую из 10 мл 100 % спирта и 10 мл 20 % раствора нитрата серебра (выпадающий осадок растворяют аммиаком, прибавляя его по каплям).

8. Переносят в 10 % формалин, меняя несколько раз до исчезновения мути.

9. Промывают в дистиллированной воде и помещают в 1 % раствор хлорного золота до появления стального цвета.

10. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия.

11. Промывают в дистиллированной воде.

12. Переносят на предметное стекло, подсушивают на воздухе, затем проводят через ацетон, ксилол, заключают в бальзам.

Результат: на сером фоне видны темные нервные клетки, ядра, нейрофибриллы в нервных клетках и синаптических волокнах, синаптические окончания.

-----------------------------------------------------------------

Методы Бильшовского

Предварительной обработкой материала для выявления нейрофибрилл, по Бильшовскому, служит фиксация нейтральным формалином. Оптимальная ее продолжительность — 3 — 6 нед после помещения в формалин, однако материал, лежавший в формалине несколько лет, также дает удовлетворительные результаты, особенно после обработки пиридином. Проводят окраску срезов (импрегнация срезов) или кусочков (тотальная импрегнация). Для получения хороших результатов необходимы точное соблюдение прописей (инструменты только стеклянные!) и применение чистых реактивов.

Импрегнация срезов

Материал фиксируют в растворе формалина (1:9) не менее 14 дней (максимальная толщина кусочков 1 см); промывают в проточной воде 2 —3 ч, затем в дистиллированной воде 1—2 дня; нарезают на замораживающем микротоме срезы толщиной .5 — 10 мкм и собирают в дистиллированную воду. Хорошие срезы вылавливают и промывают 1 — 2 раза в дистиллированной воде, которую меняют 3 — 4 раза. 

Импрегнация:

1) срезы помещают в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч;

2) быстро (2 — 3 с) проводят через дистиллированную воду, сменяя стеклянные палочки;

3) помещают в свежеприготовленный раствор аммиачного се­ребра: к 10 мл 10 % раствора нитрата серебра добавляют 5 капель 40 % раствора гидроксида натрия — образуется коричнево-черный осадок окиси серебра. После этого при постоянном взбалтывании к раствору серебра по каплям добавляют раствор аммиака (молекулярная масса 0,875 — 0,910) до тех пор, пока от растворяющегося осадка останется лишь несколько крупинок. После каждой капли выжидают 10 — 20 с, прежде чем добавить следующую каплю. Необходимо избегать избытка аммиака. Раствор разводят до 20 мл дистиллированной водой. В раствор аммиачного серебра срезы помещают на 10 — 20 мин, в нем они должны приобрести желтоватый оттенок;

4) быстро проводят через 2 — 3 порции дистиллированной воды;

5) восстанавливают в растворе формалина (1:4), не содержащем кислоты в течение 10 мин, — срезы быстро окрашиваются в темно-серый цвет;

6) промывают в воде 15 мин;

7) золотят в разбавленном растворе трихлорида золота (3 — 5 капель 1 % раствора желтого трихлорида золота на 10 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока коричневый тон не перейдет в серый или серо-фиолетовый;

8) фиксируют 1—2 мин в 5 % растворе тиосульфата натрия;

9) тщательно промывают в обычной воде (1—2 ч); проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол (не дольше, чем нужно) и заключают в бальзам.

На хорошо импрегнированных препаратах нейрофибриллы и перицеллюлярные сетчатые структуры ганглиозных клеток черного цвета выделяются на светлом фоне, так же отчетливо видны тончайшие осевые цилиндры.

К восстанавливающему 4 % раствору формалина можно добавить 1 % цитрат натрия в соотношении 1:9. В этом случае картина, получающаяся в результате серебрения, очень равномерная и более контрастная.

-----------------------------------------------------------------

Метод серебрения с предварительной обработкой пиридином

В тех случаях, когда материал предназначается главным образом для выявления осевых цилиндров, а не внутриклеточных нейрофибрилл, М. Бильшовский рекомендует предварительно обработать его пиридином (благодаря этому сильно подавляется подкраска глии и соединительной ткани). Фиксацию и предварительную подготовку материала проводят по методу Бильшовского. Замороженные срезы промывают в дистиллированной воде 1 — 2 ч и переносят в неразведенный пиридин на 24— 48 ч. Затем срезы тщательно освобождают от пиридина, промывая их в часто сменяемой дистиллированной воде до тех пор, пока не исчезнет специфический запах пиридина. После этого переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч и далее обрабатывают по методу Бильшовского.

Тотальная импрегнация

Импрегнацию целого кусочка проводят с предварительной обработкой пиридином или без нее. В последнем случае кусочки ткани размером не более 1 см3 фиксируют в формалине и без промывания переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 1 — 8 дней (в зависимости от величины). Затем перекладывают на 0,5 — 6 ч в раствор аммиачного серебра, быстро проводят через дистиллированную воду и помещают в 20 % раствор формалина на 12 —24 ч. После этого материал как можно быстрее заливают в парафин.

Более надежной является тотальная импрегнация с пиридином по Билшовскому.

1. Органы, фиксированные не менее 1 нед в нейтральном формалине (от 1:4 до 1:9), разрезают на кусочки толщиной не более 0,5 см и на 3 — 4 дня помещают в чистый неразведенный пиридин при комнатной температуре.

2. Промывают 12-24 ч в проточной воде и столько же в часто сменяемой дистиллированной воде.

3. Пропитывают в 3 % растворе нитрата серебра при 36 °С 3-5 дней.

4. Быстро ополаскивают в дистиллированной воде.

5. Помещают на 24 ч в раствор аммиачного серебра (готовят так же, как для импрегнации срезов, но доливают дистиллированной водой до 100 мл).

6. Промывают в часто сменяемой воде (по Билшовскому до 1 ч в зависимости от толщины блока, по Буке, 2 ч).

7. Восстанавливают в нейтральном формалине (1:9) 10 — 12 ч.

8. Ополаскивают в дистиллированной воде, быстро проводят через спирты, заливают в парафин; золочение и фиксацию проводят на срезах.

При тотальной импрегнации с применением пиридина можно использовать материал, находившийся в формалине в течение нескольких лет. При этом методе глия и соединительная ткань обычно отступают на задний план или выделяются благодаря иному тону окраски. Фибриллярные структуры ганглиозных клеток выявляются менее четко, чем при использовании оригинального метода, моторные и чувствительные концевые образования нервов, наоборот, видны отчетливо.

Нередко импрегнация протекает хорошо не во всем кусочке, а лишь в его определенных зонах. Более благоприятные результаты наблюдаются в эмбриональных тканях, которые легче пропитываются.

М. Бильшовский рекомендует использовать для восстановления серебра не формалин, а смесь, состоящую из 75 мл 30 % раствора фруктозы, 75 мл 10 % раствора сегнетовой соли, 20 мл 10 % раствора карбоната калия и 5 мл чистого формалина. Импрегнированные блоки помещают в эту смесь на 24 ч при 50 °С. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, обезвоживание и заливка.

Смесь может быть применена и для восстановления импрегнированных срезов. В этом случае срезы после пропитывания в растворе аммиачного серебра быстро ополаскивают и переносят на 1 — 2 мин в указанный раствор, подогретый до 50 °С. Затем следуют промывание, золочение и т.п.

С помощью восстанавливающей смеси по Бильшовскому особенно хорошо выявляются перицеллюлярные концевые образования в ЦНС.

-----------------------------------------------------------------

Метод Адэра и Витгилию

(для выявления нейрофибрилл и синапсов)

Головной мозг кошки фиксируют в дважды сменяемом ацетоне по 24 ч в каждом. Заливают в парафин в течение 18 — 24 ч. Срезы толщиной 15—20 мкм депарафинируют, промывают в 100 % спирте и опускают на 6 ч в 1 % раствор аммиака на абсолютном спирте. Затем погружают на 6 ч в пиридин. Промывают в дистиллированной воде и переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 12 ч при температуре 30 °С, затем промывают в 100 % спирте. Восстанавливают серебро в растворе пирогалловой кислоты с формалином (95 мл 95 % спирта, 3 г пирогалловой кислоты и 8 мл формалина).

Далее проводят через дважды сменяемый спирт, промывают несколько раз в дистиллированной воде и обрабатывают 1 % трихлоридом золота до обесцвечивания. Промывают в 6 —8 порциях дистиллированной воды.

Для усиления окраски срезы обрабатывают 3-4 мин в 1 % растворе щавелевой кислоты. Снова промывают в   6-8 порциях дистиллированной воды и погружают на 5-10 мин в 10 % раствор тиосульфата натрия. Далее промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилолах и заключают в бальзам.

Результат:   хорошо выражены нейрофибриллы черного цвета, видны конечные колечки и колбочки.

-----------------------------------------------------------------

Методы Рамон-и-Кахаля

Методы импрегнации нейрофибрилл, предложенные S. Ramon y Cajal, применяют преимущественно в форме тотальной импрегнации. Принцип методов основан на том, что свежевзятые кусочки ткани сразу или после фиксации спиртом пропитывают раствором нитрата серебра, а образовавшиеся при этом соединения серебра восстанавливают при последующей обработке пирогалловой кислотой или гидрохиноном.

Недостаток методов состоит в том, что в импрегнированном кусочке пригодной для исследования обычно оказывается лишь средняя зона, так как раствор серебра не проникает в глубокие слои. Наружная зона не может быть исследована вследствие сильного зачернения. Кроме того, часто происходит значительное сжатие ткани, в связи с чем общая сохранность препарата во многих случаях оказывается не очень хорошей. В новых модификациях метода импрегнации на срезах эти недостатки устраняются.

В растворах серебра препараты должны находиться все время в отсутствие света (коричневые склянки с пришлифованными пробками, обертки из картона и т.п.). Кусочки ткани не должны быть толще 3 мм.

Метод I. 

Пригоден для исследования головного мозга мелких животных, а также эмбрионов и новорожденных крупных животных, позволяет выявить пирамидные клетки большого мозга и клетки-зерна мозжечка.

1. Свежевзятые кусочки ткани помещают на 3-5 дней в 0,75-3 % раствор нитрата серебра при 35 °С до появления табачно-коричневой окраски кусочков.

2. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

3. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1-2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде 5 мин.

5. Заливают в целлоидин или парафин. 

Обезвоживать следует по возможности быстро, около 5-6 ч.

Для обработки материала, взятого у новорожденных и эмбрионов, берут 0,75 % раствор нитрата серебра, у взрослых млекопитающих—3 %, у беспозвоночных—6 % раствор. На 2—3 кусочка расходуют 80—100 мл раствора.

Метод II. 

Пригоден для выявления мякотных и безмякотных нервных волокон, перицеллюлярных разветвлений, больших и средних нервных клеток, особенно головного мозга, мозжечка, спинного мозга и, кроме того, двигательных и чувствительных нервных окончаний и регенерационных стадий.

1. Материал фиксируют в 96 % или 100 % спирте 24 ч.

2. Разрезают на кусочки толщиной 2,5—3 мм, импрегнируют 5—7 дней в 1—1,5 % растворе нитрата серебра при 30—35 °С.

3. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

4. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1—2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

5. Ополаскивают дистиллированной водой 5 мин.

6. Заливают в парафин или целлоидин; обезвоживать следует по возможности быстрее (примерно 5-6 ч).

В том случае, если импрегнация слишком светлая, срезы 5 — 10 мин обрабатывают в смеси, состоящей из 3 г тиоцианата аммония. 3 г тиосульфата натрия, 100 мл дистиллированной воды и нескольких капель 1 % раствора трихлорида золота. Если к спирту, используемому для фиксации, добавить веронал, хлоралгидрат и т.п. (на 50 мл 1 г), то для импрегнации в растворе нитрата серебра потребуется только 5 дней. Это делает метод более надежным, и он может быть применен на материале, долгое время лежавшем в спирте.

Метод III. 

Особенно показан  для выявления нейрофибрилл спинного мозга, чувствительных симпатических ганглиев человека, кошки, собаки, кролика.

Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1—12 капель (для большого мозга 1—3 капли, моз­жечка—4, спинного и продолговатого мозга—8—12, периферических окончаний — 2 —3) раствора аммиака (молекулярная масса 0,910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2—4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод IV.

Пригоден для выявления безмякотных волокон ЦНС, перицеллюлярных разветвлений, моховидных волокон мозжечка.

Материал фиксируют в смеси 15 мл формалина и 85 мл воды; промывают в проточной воде 6 — 12 ч; помещают на 24 ч в 50 мл 96 % спирта, к которому добавлено 5 капель раствора аммиака; обсушивают фильтровальной бумагой; далее обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод V. 

Хорошие результаты получают на эмбрионах, а у взрослых прежде всего при изучении нейрофибрилл, нервных окончаний и процесса регенерации нервов (за исключением первых стадий).

Материал фиксируют 24 ч в 70 % пиридине или смеси, состоящей из 40 частей пиридина и 30 частей 95 % спирта; промывают в проточной воде до исчезновения запаха 12—24 ч; переносят на 6-12 ч в 95 % спирт; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Метод VI. 

Пригоден для изучения двигательных концевых пластинок, перицеллюлярных разветвлений, мозжечка.

Материал фиксируют 24 ч в смеси, состоящей из 5 г хлоралгидрата, 25 мл 100 % спирта и 75 мл дистиллированной воды; ополаскивают в дистиллированной воде 1 мин; помещают на 24 ч в 50 мл 100 % спирта, в который добавлено 4 капли раствора аммиака; промывают 12 — 24 ч в проточной воде и 2 — 5 ч в часто сменяемой дистиллированной воде; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Импрегнация замороженных срезов. 

Метод пригоден для исследования большого мозга, мозжечка, двигательных концевых пластинок, чувствительного эпителия.

1. Материал фиксируют в формалине (1:4) 3 дня или дольше.

2. Замороженные срезы толщиной 30-40 мкм собирают в формалин.

3. После быстрого (несколько минут) промывания в дистиллированной воде помещают в смесь, состоящую из 12 мл 2 % раствора нитрата серебра, 7-10 капель пиридина и 5-6 мл 97 % спирта, в которой срезы за 4-6 ч должны стать светло-коричневыми; если этого не происходит, то следует в течение нескольких минут подогреть над пламенем.

4. Отдельные срезы на 2—4 с погружают в 100 % спирт.

5. Восстанавливают 1—3 мин в смеси, в состав которой входят 0,3 г гидрохинона, 70 мл дистиллированной воды, 20 мл формалина и 15 мл ацетона.

6. Основательно промывают в воде, золотят и фиксируют как обычно.

7. Промывают, извлекают на предметное стекло, обсушивают фильтровальной бумагой.

8. Проводят через 100 % спирт, гвоздичное масло, ксилол, заключают в бальзам.

В том случае, если с помощью этого метода не удается выявить мякотные волокна белого вещества, то перед серебряной ванной замороженные срезы 2 ч обрабатывают в смеси, состоящей из 10 мл 100 % спирта, 10 мл дистиллированной воды и 8-10 капель аммиака. Затем промывают, помещают в раствор нитрата серебра с пиридином и т.д.

-----------------------------------------------------------------

Метод Рамона—Лермитта

(выявление дегенерированных синапсов)

Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине в течение 1-2 нед или дольше. Затем его переносят на 1 ч в 40 % формалин, 2 ч промывают в проточной воде и 2 ч -в дистиллированной. Срезы толщиной 15 — 20 мкм получают на замораживающем микротоме. Из дистиллированной воды их переносят в 20 % раствор нитрата серебра при температуре 50 — 53 °С (продолжительность пребывания в этом растворе срезов спинного мозга — 50 мин, продолговатого мозга и коры головного мозга — 60 мин, мозжечка и таламуса — 80 мин). 

После импрегнации срезы должны быть табачного цвета.

1. Срезы ополаскивают в дистиллированной воде, на 5-10 мин переносят в раствор аммиачного серебра (в 20 % раствор нитрата серебра добавлять по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка в мерном стаканчике, а затем добавляют столько же раствора аммиака).

2. Промывают в дистиллированной воде.

3. Восстанавливают в формалине (1 часть формалина, 2 части водопроводной воды и 2 части дистиллированной воды) 15 мин, срезы должны стать коричнево-черными.

4. Переносят в 0,5 % раствор трихлорида, золота и держат до тех пор, пока срезы не станут серыми.

5. Закрепляют в 3 % растворе тиосульфата натрия 5 мин.

6. Промывают в дистиллированной воде (2 — 3 смены)

7. Обезвоживают в 40 % и 96 % спирте по 10 мин.

8. Просветляют в 10 % карбол-ксилоле и 2 смесях ксилола по 10 мин, заключают в бальзам.

-----------------------------------------------------------------

Методика Бильшовского 

(выявление внутриклеточных нейрофибрилл, осевых цилиндров нервных волокон и сенильных бляшек)

Служит наиболее адекватной методикой для микроскопической диагностики болезни Альцгеймера и старческого слабоумия.

Материал фиксируют в 10 % формалине не менее 2 нед. 

Срезы толщиной 8—10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в 10 % формалине, перед окраской промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

1. Переносят срезы на 24 ч в 2 % раствор нитрата серебра.

2. Ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.

3. Переносят в аммиачное серебро на 25 — 30 с.

4. Тщательно ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.

5. Помещают в 20 % нейтральный формалин на 4-5 с до приобретения темно-коричневой окраски.

6. Ополаскивают в дистиллированной воде.

7. Переносят 1—3 среза в 0,5 % раствор трихлорида золота (они должны приобрести светло-серый, мышиный, цвет без коричневых пятен).

8. Переносят в дистиллированную воду (если на срезах появятся коричневые пятна, то вновь помещают в раствор трихлорида золота до их исчезновения).

9. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин. Стеклянную палочку после погружения со срезом в тиосульфат натрия следует тщательно промыть в дистиллированной воде, протереть чистой тканью. Переносить срезы из тиосульфата натрия в трихлорид золота не следует, так как последний в этом случае темнеет и становится непригодным для использования.

10. Срезы промывают в дистиллированной воде, наклеивают на стекло, смазанное смесью белка с глицерином, затем ставят на ребро для просушки на 8 — 10 мин.

11. Просветляют в одной порции ксилола и заключают в бальзам под покровное стекло. Если препарат просветлен не полностью, т.е. имеются мутные пятна, то его следует погрузить на 2 — 3 с в ацетон, а затем вновь поместить в ксилол. Эту процедуру повторяют до полного просветления срезов.

Результат: на светлом фоне импрегнируются контуры нейронов, их ядер; в телах нейронов выявляются тонкие волокна нейрофибрилл или их патология. Между клетками видна тонкая сеть аксонов и их коллатералей. Аксосоматические терминали на поверхности тел нервных клеток выявляют изредка и частично, поэтому о количестве их говорить нельзя. Иногда в белом веществе обнаруживают волокнистые астроциты.

При правильной предварительной фиксации материала с помощью этого метода постоянно получают хорошие результаты. Засорение срезов осадками серебра происходит при использовании плохо обработанной посуды и недоброкачественного раствора серебра. При недостаточной дифференцировке в растворе трихлорида золота структуры выглядят грубо импрегнированными с коричневым оттенком, в срезе определяются коричневые пятна.

-----------------------------------------------------------------