|
ГИСТОХИМИЯ ЛИПИДОВ
Собирательный термин «липиды» охватывает жиры (т.е. триглицериды) и жироподобные вещества растительного и животного происхождения. Это преимущественно неполярные соединения, основным компонентом которых являются жирные кислоты. Липиды нерастворимы или плохо растворимы в воде, но хорошо растворяются в типичных жирорастворителях: бензине, хлороформе, четыреххлористом углероде, ацетоне, эфире, петролейном эфире, горячем спирте и т.п. Не все липиды растворимы в указанных растворителях одинаково, на этом основаны дифференциальная экстракция липидов и выявление их с помощью жирорастворимых красителей.
С учетом гистохимических свойств и химической структуры липиды делят на простые (нейтральные жиры, воски, стериды) и сложные (фосфолипиды, цереброзиды, ганглиозиды, сульфолипиды).
Гистохимическая идентификация липидов
Гистохимическое выявление липидов возможно с помощью физических и химических методов. К физическим относятся методы экстракции, поляризационная микроскопия и окрашивание жирорастворимыми красителями, к химическим — подавляющее большинство гистохимических методов выявления липидов, направленных главным образом на определение активных функциональных групп.
Экстракция липидов
В основе методов экстракции липидов лежат законы растворимости, известные из аналитической органической химии. Их необходимо также учитывать при подготовке тканей для проведения гистохимического анализа липидов. Первые потери водорастворимых липидов происходят уже при фиксации в альдегидах или тетраоксиде осмия и продолжаются в процессе обезвоживания и заливки. После первичной фиксации в тетраоксиде осмия вымываются главным образом насыщенные липиды. Особенно велики суммарные потери липидов в тканях, фиксированных в альдегидах. После двойной фиксации в альдегидах и тетраоксиде осмия достигается хорошая стабилизация структур, содержащих ненасыщенные липиды. Наибольшие потери липидов наблюдаются во время пропитки ткани парафином и эпоксидными смолами, но их можно уменьшить путем более быстрого обезвоживания и замены этанола на ацетон. Стабилизация липидов может быть значительно усилена путем добавления к альдегидной фиксирующей смеси хлорида кальция, как, например, в кальций-формоле по Бейкеру или при использовании хроматов, способных окислять ненасыщенные липиды, как в фиксаторе Элфтмана, содержащем бихромат калия и сулему. Хорошо сохраняются фосфолипиды при фиксации с одновременным обезвоживанием в ацетоне с 0,65 % хлоридом магния.
Управляя процессом экстрагирования липидов и применяя его в сочетании с методами окрашивания, гистохимия обеспечивает контроль специфичности окрашивания и дифференцированно выявляет различные липидные фракции.
Экстракция липидов по Кейлигу позволяет провести разделение четырех фракций липидов, при этом тонкие, нефиксированные кусочки ткани обрабатывают четырьмя растворителями:
а) холодным ацетоном (удаляет глицериды, холестерин, холестериды и кетостероиды);
б) горячим ацетоном (удаляет цереброзиды);
в) горячим эфиром (удаляет лецитины и кефалины) ;
г) горячим метанол-хлороформом (удаляет все липиды).
Применяют по три порции каждого растворителя, сменяя их соответственно через 3, 3 и 12 ч. Для горячих растворителей можно использовать аппарат Сокслета или более простой прибор. После экстракции кусочки ткани промывают водой, и криостатные срезы окрашивают раствором судана черного В в 70 % спирте. Следует помнить, что при использовании этого метода не удается полностью исключить диффузию, что затрудняет точную локализацию липидов, однако все же они остаются в срезе и окрашиваются Суданом.
Экстракция пиридином по Бейкеру обеспечивает удаление всех липидов. Ее проводят на тонких кусочках ткани, фиксированных слабым раствором фиксатора Буэна в течение 20 ч. После фиксации их следует промыть в спирте для удаления пикриновой кислоты, обработать пиридином сначала при комнатной температуре 30 мин, затем при 60С 20 ч, промыть в проточной воде в течение 2 ч, перенести в бихромат-кальциевый раствор (5 % бихромат калия и 1 % хлорид кальция на дистиллированной воде) и окрасить материал Суданом и черным В или любым другим жировым красителем.
Разработаны приемы липидной экстракции, обеспечивающие хорошую ультраструктурную сохранность ткани для целей электронно-микроскопической гистохимии.
Поляризационная микроскопия липидов
В нативном состоянии большинство нейтральных липидов находится в жидком состоянии и не дает двойного лучепреломления в поляризованном свете; это свидетельствует об их аморфном (изотропном) состоянии. Однако при охлаждении нейтральные липиды переходят в анизотропное состояние и могут образовывать двоякопреломляющие кристаллы. При поворачивании предметного столика поляризационного микроскопа с исследуемым препаратом на 360° можно отметить четыре положения, при которых интенсивность пришедшего света минимальна. Подобным образом ведут себя все липиды. Если же в препарате выявляется анизотропный эффект мальтийского креста, то можно сделать вывод о присутствии фосфатидов, цереброзидов или эфиров холестерина. В целом же возможности этого метода ограничены.
Флюоресцентная микроскопия липидов
Небольшая часть липидов обладает собственной, или первичной, флюоресценцией в ультрафиолетовом свете. Липопигмен-ты светятся желтым или желто-зеленым светом, липиды с растворенным каротином дают зеленую флюоресценцию, так же как и стероидные гормоны, но зеленая флюоресценция последних меняется во времени. Практическое значение имеет выявление витамина А.
Методы вторичной флюоресценции, в основе которых лежит растворение флюоресцирующих веществ (флюорохромов) в липидах тканей, позволяют устанавливать присутствие липидов в клетках и тканях точнее, чем многие другие методы. С этой целью использовали ряд флюоресцирующих красителей, в том числе метиленовый синий, тиофлавин, родамин В, бенгальский розовый, фосфин 3R, бензпирен и др. Возможность применения водных растворов таких красителей обеспечивает сохранность самых мелких капелек жира. С помощью этого метода выявляют липиды и липопротеиды в очень низких концентрациях. Особенно это относится к флюорохромированию бензпиреном. Этот высокочувствительный метод позволяет выявлять липиды в тонких структурах, входящих в состав липопротеидных комплексов или тонкодисперсных образований.
Выявление бензпиреном по Бергу
1. Материал фиксируют в формалине или кальций-формоле.
Срезы толщиной 10 мкм получают на замораживающем микротоме.
2. Обрабатывают срезы в течение 20 мин раствором бензпирен-кофеина (к 100 мл насыщенного отфильтрованного 1,5 % раствора кофеина в воде добавляют 0,002 г 3,4 бензпирена; раствор выдерживают 2 дня при 37 °С, отфильтровывают и разводят равным объемом дистиллированной воды. Оставляют на 2 ч и вновь фильтруют. Колбу с раствором плотно закрывают и помещают в темное место; в таком виде его можно хранить несколько месяцев).
3. Срезы быстро промывают в дистиллированной воде.
4. Заключают под покровное стекло с водой и сразу же исследуют под флюоресцентным микроскопом.
Результат:
липиды выделяются своей синей или бело-синей флюоресценцией.
Примечание. Этот метод не позволяет дифференцировать липиды разных классов; цвет флюоресценции — от сине-зеленой до бело-синей и бело-желтой, по-видимому, зависит от концентрации липидов.
Флюорохромирование липидов фосфином 3R
по Фольку—Попперу
Флюорохром —фосфин 3R — обусловливает яркую серебристо-белую флюоресценцию, которую легко отличить от естественной флюоресценции тканей, даже не пользуясь контрольными препаратами сравнения.
1. Материал фиксируют в кальций-формоле. Срезы толщиной 10 мкм готовят на замораживающем микротоме.
2. Срезы помещают в дистиллированную воду, затем обрабатывают 0,1 % водным раствором фосфина 3R.
3. Быстро промывают в дистиллированной воде.
4. Заключают в 90 % глицерин или дистиллированную воду, исследуют под флюоресцентным микроскопом.
Результат:
липиды, включая эфиры холестерина, дают серебристо-белую флюоресценцию. Исключение составляют жирные мыла и холестерин.
Окраска жирорастворимыми красителями
Для всех жировых красителей единственным общим признаком является отсутствие солюбилизирующих сульфогрупп (—SO3H) или карбоксильных (-СООН)-групп. Это диазокрасители, в основном красного цвета.
Судан черный В обладает более выраженными, чем суданы III и IV, красящими свойствами, хотя он может давать и гораздо более слабое окрашивание белков и кислых ГАГ.
Окраска Суданом черным по Лизону
1. Материал фиксируют в кальций-формоле, готовят срезы на замораживающем микротоме или заливают в поливакс.
2. Промывают срезы в 70 % спирте.
3. Окрашивают Суданом черным (насыщенный раствор Судана В в 70 % спирте, профильтрованный перед использованием) 20 — 30 мин.
4. Промывают в 70 % спирте 30 с.
5. Быстро промывают в дистиллированной воде.
6. Окрашивают 1 % ядерным прочным красным 1 мин.
7. Быстро промывают в дистиллированной воде и заключают в глицерин-желатин или глицерин.
Результат:
липиды окрашиваются в цвета от черного до темно-синего,
ядра — в красный цвет; окраску воспринимают также фосфолипиды.
Для контроля неспецифического окрашивания за счет адсорбции используют экстракцию ацетоном или этанолом.
Окраска масляным красным О в изопропаноле по Лилли
1. Материал фиксируют в кальций-формоле, срезы получают на замораживающем микротоме.
2. Срезы переносят в дистиллированную воду и быстро промывают в 60 % изопропаноле.
3. Срезы окрашивают 10 — 20 мин в растворе масляного красного О (0,05 г масляного красного О растворяют в 100 мл 98 % изопропанола, перед использованием разводят дистиллированной водой в пропорции 6:4, выдерживают 24 ч и затем фильтруют).
4. Быстро дифференцируют в 60 % изопропаноле или сразу же промывают в дистиллированной воде.
5. Промывают в проточной воде 10 мин.
6. Срезы заключают в глицерин-желатин.
Результат:
нейтральные жиры окрашиваются в красный цвет, ядра — в синий.
Примечание.
Масляный красный О можно также использовать в виде насыщенного отфильтрованного раствора в 70 % спирте. Вместо масляного красного О можно применять масляный красный 7В, который окрашивает липиды в ярко-красный цвет. В качестве растворителей для жировых красителей используют 55 — 70 % спирт, 65 — 98 % изопропанол, пропиленгликоль, а также смесь Герксхаймера, состоящую из равных частей 70 % спирта и ацетона.
Гистохимическое выявление фосфолипидов
Для гистохимического выявления фосфолипидов наиболее пригодны методы с использованием кислого гематеина. По методу Бейкера ткани после фиксации в кальций-формоле подвергают длительному хромированию в бихромат-кальциевой смеси, в результате чего фосфолипиды образуют нерастворимые комплексы с хромом. Эти комплексы реагируют с кислым гематеипом, который получают при окислении гематоксилина метайодатом натрия. Связанный с фосфолипидами хром, взаимодействуя с кислым гематеином, образует соединение хром-гематеин темно-синего цвета.
Окраска фосфолипидов кислым гематеином Бейкера
в модификации Бухвалова
1. Кусочки размером 2 — 4 мм фиксируют в 2 сменах ацетона с 0,65 % раствором хлорида магния по 60 мин.
2. Помещают в ксилол — 2 смены по 5—10 мин.
3. Переносят в горячий парафин — 2 смены по 30 мин.
4. Заливают в парафин и получают срезы.
5. Срезы проводят через ксилол — 2 смены по 5 мин.
6. Помещают в ацетон с 0,65 % раствором хлорида магния -2 смены по 5 мин.
7. Переносят в дистиллированную воду — 2 смены по 1 мин.
8. Помещают срезы в 5 % раствор бихромата калия при 60 °С на 4 ч.
9. Промывают в нескольких сменах дистиллированной воды.
10. Помещают срезы при температуре 37 °С на 0,5 — 5 ч в раствор кислого гематеина (50 мг кристаллического гематоксилина растворяют в 50 мл 0,1 % раствора метайодата натрия при нагревании до кипения, охлаждают и добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты).
11. Промывают в дистиллированной воде.
12. Дифференцируют при комнатной температуре в 0,25 % водных растворах дибората натрия, декагидрата и гексациано-феррата калия 18 ч.
13. Промывают в дистиллированной воде.
14. Обезвоживают в 2 сменах ацетона с 0,65 % хлоридом магния по 5 мин.
15. Проводят через 2 смены ксилола по 5 мин и заключают в бальзам.
Результат:
фосфолипиды окрашиваются в черно-синие тона.
Окраска железным гематоксилином по Элледеру и Лойде для выявления фосфолипидов
1. Срезы получают на замораживающем микротоме.
2. Срез А в сухом состоянии обрабатывают 10 мин при температуре от 0 до 4 "С абсолютным ацетоном и высушивают на воздухе.
Срез Б при комнатной температуре обрабатывают 10 мин смесью хлороформа с метанолом, а затем быстро промывают в ацетоне и дистиллированной воде.
3. Срезы А и Б фиксируют в кальций-формоле (5—10 мин), а затем промывают в дистиллированной воде.
4. Оба среза окрашивают смесью растворов I (3 части) и II (1 часть) 6-8 мин.
Раствор I:
298 мл дистиллированной воды + 2 мл концентрированной соляной кислоты + 2,5 г дихлорида железа гексагидрата + 4,5 г сульфата железа гептагидрата.
Раствор II:
1 г гематоксилина растворяют при слабом нагревании в 100 мл дистиллированной воды.
5. Промывают в дистиллированной воде, затем несколько раз в 0,2 % растворе соляной кислоты.
6. Хорошо промывают в проточной воде.
7. Заключают под покровное стекло в глицерин-желатин или после обезвоживания в ацетоне и просветления в ксилоле — в бальзам.
Результат: фосфолипиды окрашиваются в темно-синий цвет. Их можно идентифицировать, лишь сравнив с окрашиванием срезов, обработанных ацетоном и смесью хлороформа с метанолом; последние не должны давать окрашивания, обусловленного присутствием липидов.
Можно использовать также замороженные срезы тканей, фиксированных в формалине. Перед экстракцией ацетоном такие срезы следует подсушить. Продолжительность экстракции в смеси хлороформа с метанолом после фиксации в формалине должна составлять 1 —2 ч. С помощью обработки срезов гидроксидом натрия после экстракции ацетоном удается выявить сфингомиелин. Плазмалогены можно удалять с помощью гидролиза в 1 % водном или солянокислом (1 и.) растворе сулемы в течение 10 мин. Преимуществом этого метода являются быстрота и надежность.
Выявление ненасыщенных липидов
Для гистохимического выявления важна легкая окисляемость ненасыщенных липидов. Продуктом окисления непредельных связей липидов, проводимого с помощью надмуравьиной или надуксусной кислоты, в большинстве случаев являются альдегидные группы, которые могут быть выявлены с помощью реактива Шиффа.
Непредельные связи в липидах ответственны также за восстановление тетраоксида осмия и за превращение его в диоксид осмия (осмиевую чернь).
На связывание тетраоксида осмия, по-видимому, влияет также ориентация липидных молекул в тканях. На этом принципе основан тест Марчи с тетраоксидом осмия на дегенерирванный миелин. Механизм реакции Марчи был детально изучен Adams (1959), который разработал метод одновременного выявления нормального и дегенерированного миелина с помощью тетраоксида осмия и alfa-нафтиламина.
По Adams, гидрофобные липиды дегенерированного миелина окрашиваются в черный цвет в результате восстановления оксида осмия до его тетраоксида. Гидрофильные липиды нормального миелина окрашиваются в красный цвет в связи с образованием хелата осмий-alfa-нафтиламина. Таким образом, этот метод позволяет различать три типа липидов: ненасыщенные гидрофобные (черный цвет), ненасыщенные гидрофильные (красный цвет) и насыщенные (бесцветные). К первому типу относятся олеиновая кислота, трио-леин и олеат холестерина, ко второму — лецитин, кефалин, сфингомиелин и цереброзид, к третьему — стеариновая кислота, тристеарин, стеарат холестерина и холестерин.
Если перед реакцией по Адамсу провести гидролиз в 2 н. гидроксида натрия при 37 °С в течение 1 ч, то окрашиваются только устойчивые к щелочному гидролизу липиды, из которых наиболее важным в биологическом отношении является сфингомиелин; также, по-видимому, окрашивается кефалин В.
Окраска с применением тетраоксида осмия
и alfa-нафтиламина по Адамсу
1. Материал фиксируют в кальций-формоле, срезы толщиной 10—15 мкм получают на замораживающем микротоме.
2. Обрабатывают свободноплавающие срезы 18 мин в смеси, в состав которой входят 1 часть 1 % тетраоксида осмия и 3 части 1 % перхлората калия.
3. Промывают в дистиллированной воде 10 мин.
4. Срезы монтируют на покровные стекла.
5. Обрабатывают 10 — 20 мин при 37 °С насыщенным водным раствором alfa-нафтиламина (готовят путем добавления а-нафтил-амина к дистиллированной воде и последующего фильтрования после нагревания до 40 °С).
6. Промывают в дистиллированной воде 5 мин.
7. Окрашивают 2 % альциановым синим в 5 % уксусной кислоте от 15 до 60 с (под контролем микроскопии).
8. Заключают в глицерин-желатин.
Результат:
фосфолипиды окрашиваются в оранжево-красный цвет, эфиры холестерина и триглицериды — в черный.
Примечание.
Гидрофобные липиды, окрашенные в черный цвет, во многих случаях могут маскировать имеющиеся в тканях фосфолипиды. В результате гидролиза свободноплавающих срезов в 2 н. растворе гидроксида натрия в течение 1 ч при 37 "С глицерофосфолипиды вымываются, а устойчивые к действию щелочи сфингомиелины сохраняются и окрашиваются в оранжевый цвет. Этот метод выявления надежен лишь при условии предварительной фиксации срезов в абсолютном ацетоне.
Выявление холестерина
Для гистохимического выявления холестерина применяют метод Адамса с хлорной кислотой и нафтохиноном, а также метод Шультца. В основе последнего лежит окисление холестерина до оксихолестерина под действием ультрафиолетового излучения (в первоначальном варианте) или аммонийных квасцов. Хотя с помощью реакции Шультца выявляют не только холестерин и его эфиры, метод можно считать достаточно специфичным.
Модифицированная реакция Шультца для выявления
холестерина и его эфиров
1. Материал фиксируют в кальций-формоле 2 — 3 дня в холодильнике. Срезы толщиной 20 — 30 мкм получают на замораживающем микротоме.
2. Свободноплавающие срезы промывают в нескольких сменах дистиллированной воды 24 ч.
3. Срезы помещают на 7 дней при 37 "С в забуференный раствор железоаммонийных квасцов [2,5 % раствор железоаммонийных квасцов (фиолетовые кристаллы) в 0,2 М ацетатном буфере, рН 3,0; окончательная величина рН раствора около 2,0].
4. Срезы промывают в 0,2 М ацетатном буфере — 3 смены по 1 ч.
5. Промывают в дистиллированной воде.
6. Переносят в 5 % раствор формалина на 10 мин, а затем монтируют на предметные стекла, осторожно давая жидкости стечь, просушивают фильтровальной бумагой.
7. На покровное стекло наносят одну каплю, смеси равных частей химически чистых уксусной и серной кислот (серную кислоту осторожно, по каплям, добавляют к уксусной кислоте, при этом колбу лучше охлаждать на ледяной бане). Перевернутое предметное стекло со срезом осторожно кладут на покровное и слегка прижимают так, чтобы жидкость равномерно распределилась по срезу.
8. Препарат сразу же исследуют под микроскопом.
Результат:
холестерин и его эфиры через несколько секунд приобретают сине-зеленое окрашивание, через 30 — 60 мин цвет меняется на синий.
Свободный холестерин и другие Зbetta-оксистерины могут быть выявлены также на ультраструктурном уровне благодаря их способности образовывать нерастворимые в воде соединения с дигитоксином. Эту реакцию проводят одновременно с альдегидной фиксацией или после нее.
Выявление плазмалогенов
Плазмалогены, или ацетальфосфатиды, — это модифицированные глицерофосфатиды, содержащие ненасыщенный ацеталь с альдегидом. Природа этих альдегидных групп, которые высвобождаются из плазмалогенов под действием сулемы или мягкого кислотного гидролиза, точно неизвестна. В основе метода Фельгена и Фойта лежит выявление реактивом Шиффа высших альдегидов, высвобождаемых из плазмалогенов после непродолжительного воздействия сулемы. Этот же принцип реакции использован в реакции Хайеса.
Плазмалевая реакция по Хайесу
1. Материал фиксируют в кальций-формоле 3 —6 ч. Срезы получают на замораживающем микротоме.
2. Срезы прикрепляют к предметному стеклу.
3. Обрабатывают в 1 — 5 % растворе сулемы 10 мин.
4. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
5. Помещают срезы в реактив Шиффа на 20 мин.
6. Промывают срезы в 3 сменах сернистой воды по 1 мин.
7. Промывают в проточной воде 20 мин.
8. Заключают под покровное стекло в глицерин-желатин.
Результат:
в срезах, обработанных сулемой, плазмалогены
окрашиваются в красно-фиолетовый цвет.
Контрольные срезы после п. 2 переносят непосредственно в реактив Шиффа; эти срезы, не обработанные раствором сулемы, должны оставаться неокрашенными.
Примечание. Появление красноватого окрашивания — признак псевдоплазмалевой реакции, обусловленной окислением ненасыщенных липидов. Высвобождаемые в результате гидролиза липиды блокируются с помощью соответствующих реакций сочетания. Реактив Шиффа можно заменить фенилгидразином.
От плазмалевой реакции следует отличать псевдоплазмалевую реакцию тканевых и клеточных компонентов, окрашиваемых реактивом Шиффа при различных условиях.
Химическая природа соединений, дающих псевдоплазмалевую реакцию, неизвестна. Lison (1953) выделяет две группы таких соединений. К первой относятся соединения, окрашиваемые реактивом Шиффа без предварительной обработки, содержащиеся в эластиновых волокнах, миелине, некоторых клетках гипофиза, цитоплазме яйцеклеток и нервных волокнах. Во вторую группу входят соединения, реагирующие с реактивом Шиффа после предварительной обработки. В первую очередь это липиды, легко окисляемые йодной кислотой и некоторыми другими слабыми окислителями.
Обычная формалиновая фиксация подавляет плазмалевую реакцию. Интенсивность последней, наоборот, увеличивается при продолжительной фиксации формалином.
Выявление жирных кислот и триглицеридов
Для гистохимического выявления жирных кислот существуют два подхода: образование солей красителя в реакциях жирных кислот с некоторыми основными красителями и омыление жирных кислот солями металлов. Более интенсивно разрабатывается второй подход.
В методе Хольцингера ионы меди, связываемые жирными кислотами, выявляются рубеановодородной кислотой, которая образует с ними окрашенное комплексное соединение.
Выявление жирных кислот по Хольцингеру
1. Срезы нефиксированного материала получают на замораживающем микротоме.
2. Обрабатывают 0,05 % водным раствором ацетата меди 3 — 5 ч.
3. Промывают в 2 сменах 0,1 % раствора динатриевой соли ЭДТА при рН 7,1 по 10 с.
4. Промывают в дистиллированной воде.
5. Обрабатывают в течение 10 мин в 0,1 % растворе рубеановодородной кислоты в 70 % спирте (100 мл рубеановодородной кислоты растворяют в 70 мл абсолютного спирта при легком нагревании, после охлаждения раствор доводят до 100 мл дистиллированной водой).
6. Промывают несколько минут в 70 % спирте, а затем в дистиллированной воде.
7. Окрашивают (в случае необходимости) ядерным прочным красным.
8. Заключают в глицерин-желатин.
Можно обезводить в спиртах возрастающей концентрации, провести через ксилол и заключить в бальзам.
Результат:
жирные кислоты окрашиваются в зеленовато-черный цвет.
Реакция омыления лежит также в основе метода Адамса для выявления жирных кислот триглицеридов. При этом эфирные связи триглицеридов сначала расщепляются липазой, а затем высвободившиеся жирные кислоты переводятся в осадок в виде нерастворимых кальциевых мыл. С целью электронно-микроскопического выявления проводят обмен оснований с образованием свинцовых мыл. Для обнаружения продуктов гистохимической реакции в световой микроскопии препарат обрабатывают раствором сульфида аммония с образованием коричневого осадка сульфида свинца. Специфичность этой реакции может быть проконтролирована с помощью ингибиторов липазы: 0,01 М растворов цинка, свинца, меди и ЭДТА.
Выявление триглицеридов по Адамсу
1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в течение 4 ч при 4 °С в 3 % глутаровом альдегиде на 0,067 М какодилатном буфере (рН 7,4).
2. Промывают в 7,5 % сахарозе на буфере в течение 18 ч.
3. Срезы толщиной 50 мкм получают на замораживающем микротоме.
4. Срезы инкубируют в течение 30 мин в среде, в состав которой входят 50 мг панкреатической липазы, 10 мл 2 % раствора хлорида кальция, 15 мл 0,2 М трис-буфера (рН 7,0) и 25 мл дистиллированной воды.
5. Тщательно промывают в дистиллированной воде.
6. Помещают срезы на 15 мин в 1 % раствор нитрита свинца.
7. Промывают в дистиллированной воде,
8. Дополнительно фиксируют в 1 % растворе тетраоксида осмия в течение 18 ч.
9. Обезвоживают, заключают.
Результат:
в участках прохождения реакции выявляются оптически плотные игольчатые кристаллы свинцового мыла.
| 
